Unser kombinierter Ansatz hilft zu beantworten, wie sich ultrastrukturelle Neuroplastizitätsparameter nach frühen Entwicklungsinterventionen in das entstehende Nervensystem in utero ändern. Der Hauptvorteil unserer Methode ist die Erfassung hochauflösender Bilder von Makro-Meso-Mikro- und Nanostrukturen im vordefinierten Koordinatensystem innerhalb eines Gewebeatlas. Die Implikation unserer Methode ist ihr translationales therapeutisches Potenzial für angeborene neurodegenerative Erkrankungen.
Zum Beispiel, Behandlung und Rettung in embryonalen Stadien mit diesem in utero Transduktionstechnik. Unsere Methode kann auf jedes andere Modell angewendet werden. Zum Beispiel können die Mausarten geändert werden, sowie das Gebiet von Interesse.
Forscher, die unsere Methode zum ersten Mal ausprobieren, benötigen eine profunde chirurgische Ausbildung sowie das Wissen, wie das Gewebe auf die elektronenmikroskopische Bildgebung vorbereitet werden kann. Beginnen Sie mit dem Laden einer kundenspezifischen Kapillarspitze, die viermal 10 auf die 11 Viruspartikel der Adeno-assoziierten Virustyp-1-Beschichtung für das gewünschte Ziel enthält, und beschriftet mit Fast Green Farbstoff auf ein Saugrohr. Fügen Sie 15 Mikroliter der beschrifteten Adeno-assoziierten Viruspartikel in die Kapillare ein.
Als nächstes bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in einem anästhesierten embryonalen Tag 14.5 schwangere Maus, und desinfizieren Sie die Haut. Verwenden Sie gekrümmte gezackte Iris Zangen und gerade Hartmetallschere, um einen Hautschnitt entlang der Linea Mediana zu machen. Mit geraden Dumont Pinzetten, um die Peritonealwand zu greifen, weiter entlang der linea alba mit geraden Vannas Schere und legen Sie ein Stück fenestrated Paraffin Film über die Bauchöffnung und verwenden Sie ein Löffel-ähnliche Gerät, um die Gebärmutterhörner zu belichten, ohne die Embryonen in den Hörnern zu beschädigen.
Nach der Anwendung einiger Tropfen 37-Grad-Celsius PBS auf die Gebärmutterhörner, überprüfen Sie die Embryonen auf Schäden oder Fehlbildungen im Inneren des Gebärmuttersacks. Drehen Sie die Embryonen vorsichtig in ihren Säcken, bis die gewünschte Position für jede Injektion erreicht ist. Wenn die Embryonen vorhanden sind, injizieren Sie jedem Embryo ein bis zwei Mikroliter der fast grün markierten Viruspartikellösung.
Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, legen Sie die Uterushörner wieder in die Bauchhöhle und fügen Sie ein paar Tropfen 37-Grad-Celsius PBS in den Bauch. Verwenden Sie dann Polyamid 6-0 große Nähte, um die Peritonealwand und Polyamid 3-0 Größe Nähte und Halsted s Mosquito hämostatische Zange zu schließen, um die Haut zu schließen. Um isolierte Gewebe einzubetten, die für die Telemakrofotografie von Interesse sind, legen Sie die Gewebeprobe in einen speziellen Rahmen mit dem reproduzierbaren Schnittwinkel und dokumentieren Sie die Koordinaten.
Füllen Sie den Rahmen mit 30-Grad-Celsius 3%Agarose, bis das Gewebe bedeckt ist, und bedecken Sie den Rahmen mit einem Kunststoffdeckel, bis die Agarose verhärtet ist. Während die Agarose aushärtet, verwenden Sie das Telemakro-Grafikgerät, um das eingebettete Gewebe und seine Koordinaten innerhalb des Rahmens abzubilden. Wenn sich die Agarose verfestigt hat, übertragen Sie das agarose-eingebettete Gewebe in den Rahmen mit Schnittlücken, die den Koordinaten des ersten Rahmens entsprechen.
Verwenden Sie ein Gerät mit einer dünnen und vibrierenden Rasierklinge, um das eingebettete Gewebe in Abschnitte mit einer geeigneten experimentellen Dicke zu schneiden. Zeigen Sie dann jeden Gewebeabschnitt in PBS ab, und sammeln Sie die Bilder in einem Ordner. Zur Vorbereitung der Gewebeproben für die Transmissionselektronenmikroskopie in einem Biosicherheitsschrank die Gewebeabschnitte mit zwei 30-minütigen Waschungen in PBS zu waschen, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation in 2% wässriger Osmiumtetroxidlösung bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation die osmischen Abschnitte zwei weitere Male in PBS für 30 Minuten pro Waschen waschen und dehydrieren Sie die Abschnitte in sequenziellen 10-bis 15-minütigen Ethanol-Eintauchen, wie angegeben. Nach dem 70%Ethanol-Eintauchen legen Sie jede Probe in eine schwarze Schale auf einem stumpfschwarzen Hintergrund und stellen Sie die Proben in 70% Ethanol unter LED-RGB-Licht auf die Proben von der linken und rechten Seite in 45-Grad-Winkeln auf. Erstellen Sie einen Atlas der Schnittbilder mit Koordinaten, indem Sie Bilder der Samples in Reihe in einem Ordner sammeln.
Behandeln Sie die Proben mit zwei 30-minütigen 100%Ethanol-Inkubationen, gefolgt von zwei 30-minütigen 100%propylenoxid-Inkubationen, beide bei Raumtemperatur. Während der Inkubation der Proben, mischen Sie frisch zubereitetes Harz mit Propylenoxid im Verhältnis eins zu eins und eins zu zwei, und fügen Sie 3% Beschleuniger zu beiden Lösungen hinzu. Nach der zweiten Propylenoxid-Inkubation die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in die ein-zu-zwei Harzpropylen-Einbettmedium-Lösung übertragen, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation in der eins-zu-eins-Harz-Propylenoxid-Einbettmediumlösung bei Raumtemperatur.
Am Ende der zweiten Inkubation das Gewebe in flache Polypropylenschalen übertragen und das eingebettete Gewebe mit frischem Harz mit 3% Beschleuniger für 12 bis 24 Stunden bei 65 bis 85 Grad Celsius aushärten. Dann kühlen Sie das Gewebe auf Raumtemperatur, und entfernen Sie die harzeingebetteten Proben aus den Polypropylen-Geschirr. Um ein Interessengebiet zu kartieren, wählen Sie ein Bild aus, das den Interessenbereich enthält, aus dem zuvor erstellten Bildatlas.
Skizzieren Sie die Ränder des Interessenbereichs auf das schnittförmige Bild, überlagern Sie diese Grenzen optisch auf die eingebettete Probe unter dem Mikroskop, und verwenden Sie eine ein Zoll große 26-Spur-Nadel, um diese Bereichsgrenzen auf die Harzprobe zu kratzen. Dann erhitzen Sie die Proben auf 95 Grad Celsius, um das Harz zu erweichen. Als nächstes nehmen Sie die warmen Harzproben aus dem Ofen und verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Bereiche von Interesse zu verbrauchen.
Kleben Sie die Proben auf Acrylglashaltestäbe des entsprechenden Kalibers und stutzen Sie die montierten Proben für halb- und ultradünne Schnitte. Verwenden Sie ein Ultramikrotom, um halbdünne 0,7-Mikrometer- und ultradünne 70-Nanometer-Abschnitte zu erwerben, die die hauchdünnen Abschnitte auf Glasträgern und die ultradünnen Abschnitte auf Nickelgittern sammeln. Färben Sie die halbdünnen Abschnitte vier Minuten lang mit 1%Toluidinblau in PBS, gefolgt von mehreren Wärteilen in entionisiertem Wasser, bevor Sie die Abschnitte durch Lichtmikroskopie untersuchen.
Die ultradünnen Abschnitte können dann ohne weitere Modifikation direkt durch Transmissionselektronenmikroskopie bei 180 Kilovolt beurteilt werden. Nach dem Schnitt werden die Gewebescheiben durch Telemakrofotografie abgebildet, wie gerade gezeigt. Nach DerOsmierung und Demintauchung von Ethanol werden die Abschnitte durch Interferenzlicht-Telemacrographie wieder abgebildet, wodurch ein speziell gefärbtes Muster für jede Gewebeoberfläche offenbart wird.
Nach zusätzlicher Austrocknung und Harzeinbettung werden die Interessengebiete ausgewählt und für die Transmissionselektronenmikroskopie weiterverarbeitet. Im Hippocampus und Kleinhirn, Moosfaser-Synapsen sind dafür bekannt, einzigartige ultrastrukturelle Eigenschaften im Vergleich zu anderen Synapsen aufweisen, einschließlich großer präsynaptischer Boutons. In ihren Querschnittsprofilen enthalten die Boutons eine große Anzahl von Vesikeln und Mitochondrien und umschließen sehr oft mehrere dendritische Stacheln.
Im Rückenmark enthält der dorsale Funiculus viele axonale Fasern, die durch Oligodendroglia myeliniert werden. Auf querenden Abschnitten findet sich der dorsale Funiculus zwischen beiden hinteren Hörnern des Rückenmarks. Bei Transmissionselektronenmikroskopiebildern erscheinen querschnittsförmige myelinierte Axone rund, und die Myelinscheiden, die die Axone umgeben, sind in der Lamellen organisiert.
Der erstellte Atlas und die mikrografische Transmissionselektronenmikroskopie der ultrastrukturellen Parameter sind nicht nur hilfreich für den Vergleich der morphologischen Neuroplastizität verschiedener Abschnitte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen, sondern auch für Vergleiche zwischen Parametern innerhalb desselben Bereichs. Denken Sie daran, gründlich zu planen und vorzubereiten, bevor Sie die in utero Transduktion beginnen, und sicher sein, Backup von Materialien und Instrumenten im Falle von Komplikationen zu haben. Nach unserer Methode können andere Techniken hinzugefügt werden, wie z. B. die Immunogold-Etikettierung vor der Elektronenmikroskopie zur ultrastrukturellen Rückverfolgung eines definierten Moleküls von Interesse.
Ausgehend von einer ganzheitlichen Sicht auf den gesamten Organismus und dem Zoomen in Richtung molekularer Topographie sind wir in der Lage, die Beziehung zwischen Gewebefunktion und Morphologie zu untersuchen und zu manipulieren. Osmiumtetroxid ist gefährlich. Achten Sie darauf, immer unter der Haube zu arbeiten, und Schutzbrille und Handschuhe zu tragen, wenn Sie mit diesem Reagenz arbeiten.
