Nossa abordagem combinada ajuda a responder como os parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural mudam após intervenções de desenvolvimento precoces ao sistema nervoso nascente no útero. A principal vantagem do nosso método é a aquisição de imagens de alta resolução de macro-meso-micro-e nanoestruturas no sistema de coordenadas predefinido dentro de um atlas de tecido. A implicação do nosso método é seu potencial terapêutico translacional para doenças neurodegenerativas congênitas.
Por exemplo, tratamento e resgate em estágios embrionários usando isso na técnica de transdução do útero. Nosso método pode ser aplicado a qualquer outro modelo. Por exemplo, as espécies de camundongos podem ser alteradas, bem como a área de interesse.
Pesquisadores que tentam nosso método pela primeira vez precisam de treinamento cirúrgico profundo, bem como o conhecimento de como preparar o tecido para imagens microscópicas eletrônicas. Comece carregando uma ponta capilar personalizada contendo quatro vezes 10 às 11 partículas virais do revestimento do vírus associado ao adeno tipo 1 para o alvo desejado, e rotulado com corante Fast Green em um tubo aspirador. Adicione 15 microliters das partículas de vírus adeno rotuladas no capilar.
Em seguida, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um camundongo anestinado embrionário 14,5, e desinfete a pele. Use fórceps de íris serrilhadas curvas e tesouras de carboneto de tungstênio reto para fazer uma incisão de pele ao longo da linha mediana. Usando pinças retas de Dumont para segurar a parede peritoneal, continue ao longo da linha alba com uma tesoura vannas reta e coloque um pedaço de filme de parafina fenestrated sobre a abertura abdominal e use um dispositivo semelhante a colher para expor os chifres uterinos sem danificar os embriões dentro dos chifres.
Depois de aplicar algumas gotas de PBS de 37 graus Celsius nos chifres uterinos, inspecione os embriões em busca de danos ou malformações dentro do saco uterino. Gire os embriões cuidadosamente dentro de seus sacos até que a posição desejada para cada injeção seja alcançada. Quando os embriões estiverem no lugar, injete um a dois microlitadores da solução de partículas de vírus rotulada pelo Fast Green em cada embrião.
Depois de todos os embriões terem sido injetados, coloque os chifres uterinos de volta na cavidade abdominal, e adicione algumas gotas de PBS de 37 graus Celsius no abdômen. Em seguida, use suturas de tamanho poliamida 6-0 para fechar a parede peritoneal e as suturas de tamanho poliamida 3-0 e fórceps hemostáticos mosquito de Halsted para fechar a pele. Para incorporar tecidos isolados de interesse para fotografia tele-macro, coloque a amostra de tecido em um quadro especial com o ângulo de secção reprodutível e documente as coordenadas.
Encha o quadro com 30 graus-Celsius 3% agarose até que o tecido esteja coberto, e cubra a estrutura com uma tampa plástica até que a agarose tenha endurecido. Enquanto a agarose está endurecendo, use o dispositivo gráfico tele-macro para imaginar o tecido incorporado e suas coordenadas dentro do quadro. Quando a agarose se solidificar, transfira o tecido incorporado à agarose para o quadro com lacunas de corte correspondentes às coordenadas do primeiro quadro.
Use um dispositivo com uma lâmina de barbear fina e vibrante para cortar o tecido incorporado em seções de uma espessura experimental apropriada. Em seguida, exa imagem cada seção de tecido no PBS e coletar as imagens em uma pasta. Para preparar as amostras de tecido para a microscopia eletrônica de transmissão, em um armário de biossegurança, lave as seções teciduais com duas lavagens de 30 minutos em PBS, seguidas de uma incubação de duas horas em solução de tetroxida de 2%aquoso de ósmio à temperatura ambiente.
Ao final da incubação, lave as seções osmicadas mais duas vezes em PBS por 30 minutos por lavagem e desidrate as seções em imersões sequenciais de etanol de 10 a 15 minutos, conforme indicado. Após a imersão de 70% de etanol, coloque cada amostra em um prato preto em um fundo preto maçante e imagem as amostras em 70% de etanol sob luz LED RGB aplicada às amostras dos lados esquerdo e direito em ângulos de 45 graus. Crie um atlas das imagens da seção com coordenadas coletando imagens das amostras em série em uma pasta.
Trate os espécimes com duas incubações de 30 minutos e 100% de etanol, seguidos por duas incubações de óxido de propileno de 30 minutos, ambas em temperatura ambiente. Enquanto as amostras estão incubando, misture resina recém-preparada com óxido de propileno em proporções de um para um e de um a dois, e adicione 3% de acelerador a ambas as soluções. Após a segunda incubação de óxido de propileno, transfira as amostras para a solução média de incorporação de óxido de propileno de resina de uma a duas por duas horas à temperatura ambiente, seguida de uma incubação de duas horas na solução de incorporação de óxido de propileno de resina de um para um à temperatura ambiente.
No final da segunda incubação, transfira os tecidos em pratos de polipropileno plano, e cure os tecidos embutidos com resina fresca contendo acelerador de 3% por 12 a 24 horas a 65 a 85 graus Celsius. Em seguida, esfrie o tecido à temperatura ambiente, e remova as amostras embutidas em resina dos pratos de polipropileno. Para mapear uma área de interesse, selecione uma imagem contendo a área de interesse do atlas de imagem previamente preparado.
Esboce as bordas da área de interesse na imagem seccionada, sobrepõe opticamente essas bordas ao espécime incorporado sob o microscópio, e use uma agulha de calibre de 26 polegadas para arranhar essas bordas da região no espécime de resina. Em seguida, aqueça os espécimes a 95 graus Celsius, a fim de suavizar a resina. Em seguida, retire os espécimes de resina quente do forno, e use uma lâmina de barbear para extiridar as áreas de interesse.
Cole os espécimes em barras de vidro acrílico do calibre apropriado e corte os espécimes montados para seção semi e ultrafina. Use um ultramicroome para adquirir seções semifinas de 0,7 micrômetros e seções ultrafinas de 70 nanômetros, coletando as seções semifinas em portadores de vidro e as seções ultrafinas em grades de níquel. Manche as seções semifinas com 1%azul toluidina em PBS por quatro minutos, seguidas por várias lavagens em água desionizada, antes de examinar as seções por microscopia leve.
As seções ultrafinas podem então ser diretamente avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão a 180 quilovolts sem modificações adicionais. Após a secção, as fatias de tecido são imagens pela fotografia tele-macro como apenas demonstrado. Após a osmicação e a imersão do etanol, as seções são novamente imagens por interferência da tele-macografia leve, revelando um padrão especificamente colorido para cada superfície do tecido.
Após desidratação adicional e incorporação de resina, as áreas de interesse são selecionadas e processadas para a microscopia eletrônica de transmissão. No hipocampo e no cerebelo, as sinapses de fibra de musgo são conhecidas por apresentar características ultraestruturais únicas quando comparadas a outras sinapses, incluindo grandes boutons pré-sinápticos. Em seus perfis transversais, os boutons contêm um grande número de vesículas e mitocôndrias, e muitas vezes incluem várias espinhas dendríticas.
Na medula espinhal, o funiculus dorsal contém muitas fibras axonais que são mielinadas por oligodendroglia. Nas seções transversais, o funículo dorsal pode ser encontrado entre os chifres posteriores da medula espinhal. Em imagens de microscopia eletrônica de transmissão, axônios mieliados transversais aparecem redondos, e as baias de mielina ao redor dos axônios são organizadas no lamellae.
O atlas preparado e as imagens micrográficas de microscopia eletrônica de transmissão dos parâmetros ultraestruturais não são apenas úteis para a comparação da neuroplasticidade morfológica de diferentes seções em várias condições de tratamento, mas também para comparações entre parâmetros dentro da mesma área. Lembre-se de planejar e preparar-se minuciosamente antes de iniciar a transdução no útero, e certifique-se de ter backup de materiais e instrumentos em caso de complicações. Seguindo nosso método, outras técnicas podem ser adicionadas, como rotulagem de imunogold antes da microscopia eletrônica para rastreamento ultraestrutural de uma molécula de interesse definida.
Começando com uma visão holística de todo o organismo e ampliando-se em direção à topografia molecular, somos capazes de estudar e manipular a relação entre função tecidual e morfologia. Tetroxida de ósmio é perigoso. Certifique-se de sempre trabalhar sob o capô, e usar óculos de proteção e luvas de mão ao trabalhar com este reagente.
