我々の組み合わせアプローチは、子宮内の新生神経系への早期発達介入後に超構造的神経可塑性パラメータがどのように変化するかを答えるのに役立つ。我々の方法の主な利点は、組織アトラス内の定義済み座標系におけるマクロメソマイクロおよびナノ構造体の高解像度画像の取得である。我々の方法の意味は、先天性神経変性疾患の翻訳治療の可能性である。
例えば、子宮導入技術でこれを用いた胚期における治療および救助。この方法は他のモデルに適用できます。例えば、マウスの種は、同様に、関心のある領域を変更することができます。
私たちの方法を初めて試す研究者は、深遠な外科訓練だけでなく、電子顕微鏡イメージングのための組織を準備する方法の知識が必要です。目的の標的に対してアデノ関連ウイルス1型1コーティングの11個のウイルス粒子に4回10を含むカスタマイズされた毛細管先端をロードし、吸引管に高速グリーン染料で標識することから始めます。標識されたアデノ関連ウイルス粒子の15マイクロリットルを毛細血管に加える。
次に、麻酔下の胚性マウス14.5日目のつまみつまみへの応答の欠如を確認し、皮膚を消毒する。湾曲した鋸歯状の虹彩鉗子とまっすぐな炭化物はさみを使用して、リアナ・メナーマに沿って皮膚切開を行います。まっすぐなデュモンピンセットを使用して腹壁をつかみ、まっすぐなヴァンナハサミでリニアアルバに沿って続け、腹部の開口部の上にフェネレートされたパラフィンフィルムの一部を置き、角の中の胚を損傷することなく、子宮ホーンを露出させるためにスプーンのような装置を使用します。
子宮の角に37°C PBSの数滴を適用した後、子宮嚢内の損傷または奇形がないか胚を検査する。各注射の所望の位置が達成されるまで、胚を嚢の中に慎重に回します。胚が所定の位置にある場合は、各胚にファーストグリーン標識ウイルス粒子溶液の1〜2マイクロリットルを注入する。
すべての胚が注入された後、子宮の角を腹腔に戻し、腹部に37°CPBSの数滴を加える。その後、ポリアミド6-0サイズの縫合糸を使用して腹膜壁とポリアミド3-0サイズの縫合糸とハルステッドのモスキートヘモスタティック鉗子を閉じて皮膚を閉じます。テレマクロ撮影に関心のある孤立した組織を埋め込むには、組織サンプルを再現可能な断面角度を持つ特別なフレームに入れ、座標を文書化します。
組織が覆われるまで30°C3%アガロースでフレームを充填し、アガロースが硬化するまでプラスチック製の蓋でフレームを覆います。アガロースが硬化している間、フレーム内の埋め込まれた組織とその座標を画像化するためにテレマクログラフィックデバイスを使用します。アガロースが固まったら、第1フレームの座標に対応する切断隙を有して、アガロース埋め込まれた組織をフレームに移す。
薄く振動カミソリの刃を備えた装置を使用して、埋め込まれた組織を適切な実験の厚さのセクションに切断します。次に、PBSの各組織セクションを画像化し、画像をフォルダに集めます。透過電子顕微鏡用の組織サンプルを調製するために、バイオセーフティキャビネットで、PBSで2回の30分間の洗浄で組織切片を洗浄し、続いて2%水性四酸化オスミウム溶液を室温で2時間培養します。
インキュベーションの終わりに、PBSでさらに2回、洗浄につき30分間、浸透したセクションを洗浄し、示されているように10〜15分間の連続したエタノール浸漬でセクションを脱水します。70%エタノール浸漬後、各サンプルを黒い黒い背景に黒い皿に入れ、45度の角度で左右の側面からサンプルに適用されるLED RGB光の下で70%エタノールで標本をイメージします。フォルダー内のシリーズのサンプルの画像を収集することにより座標を使用してセクション画像の地図帳を作成します。
2つの30分100%エタノールインキュベーションで試料を処理し、続いて室温で2つの30分100%プロピレンオキシドインキュベーションを行います。サンプルがインキュベートされている間、1対1および1対2の比率でプロピレンオキシドと作りたての樹脂を混合し、両方の溶液に3%の加速剤を加えます。第2のプロピレンオキシドインキュベーション後、試料を室温で2時間、1対1の樹脂プロピレンオキシド埋め込み液溶液中に2時間インキュベーションして、室温で1対2の樹脂プロピレンオキシド埋め込み培地溶液に移します。
2回目のインキュベーションの終わりに、組織を平らなポリプロピレン皿に移し、65〜85°Cで12〜24時間3%の加速器を含む新鮮な樹脂で埋め込まれた組織を治す。その後、組織を室温まで冷却し、ポリプロピレン製の皿から樹脂埋め込み標本を取り除きます。対象領域をマップするには、以前に準備した画像アトラスから対象領域を含む画像を選択します。
断面化された画像に対象領域の境界をスケッチし、これらの境界を顕微鏡下の埋め込み標本に光学的に重ね合わせ、1インチ26ゲージ針を使用してこれらの領域の境界を樹脂標本に傷つけます。その後、樹脂を軟化させるために、試料を95°Cに加熱します。次に、オーブンから暖かい樹脂の標本を取り出し、カミソリの刃を使用して対象領域を切除します。
適切な口径のアクリルガラス保持バーに標本を接着し、半および超薄い切断のために取り付けられた標本をトリミングします。超マイクロトームを使用して、半薄型0.7マイクロメートルと超薄型70ナノメートルのセクションを取得し、ガラスキャリアの半薄いセクションとニッケルグリッドの超薄いセクションを収集します。PBSで1%トルイジンブルーの半薄いセクションを4分間染色し、続いて脱イオン水で数回の水を流し、軽い顕微鏡でセクションを調べる。
超薄型断面は、さらに変更することなく、180キロボルトの透過電子顕微鏡検査によって直接評価することができます。断面化後、ティッシュスライスは、ちょうど実証したように、テレマクロ写真によって画像化されます。浸透およびエタノール浸漬後、各セクションは干渉光テレマクログラフィーによって再び画像化され、各組織表面に特異的に着色されたパターンを明らかにする。
追加の脱水および樹脂埋め込み後、対象領域を選択し、さらに透過電子顕微鏡のために処理される。海馬や小脳では、苔むした繊維シナプスは、シナプス前の大型ブトンを含む他のシナプスと比較してユニークな超構造的特性を示すことが知られている。彼らの断面プロファイルでは、ブトンは膨大な数の小胞とミトコンドリアを含み、非常に頻繁にいくつかの樹状脊椎を囲みます。
脊髄では、背骨の真菌は、オリゴデンドロリアによってミリン化される多くの軸索繊維を含む。横切り部では、脊髄の後角の両方の間に後部真菌が見られる。透過型電子顕微鏡画像では、断面化されたミエリン軸索が丸く現れ、軸索を取り巻くミエリン鞘はラメラに組織化されています。
調製されたアトラスと超構造パラメータの顕微鏡顕微鏡画像は、様々な治療条件下での異なるセクションの形態学的神経可塑性の比較だけでなく、同じ領域内のパラメータ間の比較にも有用である。子宮内の導入を開始する前に徹底的に計画し、準備し、合併症の場合には材料や器具のバックアップを持っていることを確認することを忘れないでください。我々の方法に従って、他の技術は、対象となる定義された分子の超構造トレースのための電子顕微鏡の前に免疫金標識のような追加することができる。
生物全体の全体的な視点から始まり、分子地形に向かってズームインし、組織機能と形態の関係を研究し、操作することができます。四酸化オスミウムは危険です。常にボンネットの下で作業し、この試薬で作業するときは保護メガネと手手袋を着用してください。
