우리의 결합된 접근은 자궁에 있는 초기 신경계에 초기 발달 내정간섭 후에 초구조신경 가소성 매개변수가 어떻게 변화하는지 대답하는 것을 돕습니다. 우리 방법의 주요 장점은 조직 아틀라스 내의 미리 정의 된 좌표 시스템에서 매크로 메소 마이크로 및 나노 구조의 고해상도 이미지를 획득하는 것입니다. 우리의 방법의 의미는 선천성 신경 퇴행성 질환에 대한 번역 치료 잠재력입니다.
예를 들어, 자궁 경색 기법에서 이를 사용하여 배아 단계에서 치료 및 구조. 우리의 방법은 다른 모델에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 마우스 종은 관심 영역뿐만 아니라 변경할 수 있습니다.
처음으로 우리의 방법을 시도하는 연구원은 전자 현미경 화상 진찰을 위한 조직을 준비하는 방법의 지식뿐만 아니라 심오한 외과 훈련이 필요합니다. 먼저 원하는 표적을 위해 아데노 관련 바이러스 유형 1 코팅의 11가지 바이러스 입자에 4회 10번 을 포함하는 맞춤형 모세관 팁을 적재하고, 패스트 그린 염료로 흡착튜브에 부착한다. 라벨이 부착된 아데노 관련 바이러스 입자의 15마이크로리터를 모세관에 추가합니다.
다음으로, 마취배아의 날 14.5 임신 마우스에서 발가락 꼬집어에 대한 반응의 부족을 확인하고, 피부를 소독한다. 곡선 된 세상 홍채 집게와 직선 텅스텐 초경 가위를 사용하여 리나 중앙 값을 따라 피부 절개를합니다. 직선 두몬트 핀셋을 사용하여 복막 벽을 잡고, 직선 반나스 가위와 라인나 알바를 따라 계속하고 복부 개구부 위에 회귀 파라핀 필름의 조각을 배치하고 뿔 내부의 배아를 손상시키지 않고 자궁 뿔을 노출하는 숟가락 같은 장치를 사용합니다.
자궁 경적에 섭씨 37도 PBS를 몇 방울 떨어 뜨린 후 자궁 낭 내부의 손상이나 기형에 대한 배아를 검사합니다. 각 주사에 대해 원하는 위치가 달성 될 때까지 배아를 주머니 안쪽에 주의 깊게 돌립니다. 배아가 제자리에 있을 때, 각 태아에 Fast Green 표지된 바이러스 입자 용액의 1~2개의 마이크로리터를 주입하십시오.
모든 배아가 주입된 후 자궁 뿔을 복강으로 다시 배치하고 37도 섭씨 PBS를 복부에 몇 방울 더 넣습니다. 그런 다음 폴리아미드 6-0 크기의 봉합사를 사용하여 간막 벽과 폴리아미드 3-0 크기의 봉합사 및 Halsted의 모기 혈전성 집게를 닫아 피부를 닫습니다. 텔레 매크로 사진에 대한 관심의 격리 된 조직을 포함하려면, 재현 가능한 단면 각도와 특수 프레임에 조직 샘플을 배치하고 좌표를 문서화.
조직이 덮을 때까지 30도 섭씨 3%아가로즈로 프레임을 채우고 아가로즈가 굳어질 때까지 플라스틱 뚜껑으로 프레임을 덮습니다. 아가로즈가 경화되는 동안 텔레 매크로 그래픽 장치를 사용하여 내장된 조직과 프레임 내의 좌표를 이미지합니다. 아가로즈가 고화되면, 아가로즈 임베디드 조직을 첫 번째 프레임의 좌표에 해당하는 절단 갭으로 프레임으로 옮기는다.
얇고 진동하는 면도날을 가진 장치를 사용하여 임베디드 조직을 적절한 실험 두께의 섹션으로 자른다. 그런 다음 PBS의 각 조직 섹션을 이미지화하고 이미지를 폴더로 수집합니다. 전염 전자 현미경 검사법을 위한 조직 샘플을 준비하기 위하여는, 생물 안전 캐비닛에서, PBS에 있는 2개의 30 분 세척으로 조직 단면도를 세척하고, 실온에서 2% 수성 osmium tetroxide 용액에 2 시간 인큐베이션에 선행됩니다.
인큐베이션이 끝나면 PBS에서 30분 동안 2회 더 세척하고 표시된 대로 순차적으로 10-15분 에탄올 몰입으로 섹션을 탈수합니다. 70%에탄올 침수 후, 각 샘플을 둔한 검은 색 배경에 검은 색 접시에 넣고 45도 각도로 왼쪽과 오른쪽의 샘플에 적용된 LED RGB 빛 아래 의 표본을 70% 에탄올로 이미지합니다. 폴더에서 일련의 샘플 이미지를 수집하여 좌표로 섹션 이미지의 아틀라스를 만듭니다.
시편을 30분 100% 에탄올 인큐베이션 2개로 처리하고, 실온에서 30분 100% 프로필렌 산화물 배양 2개를 넣습니다. 시료가 배양되는 동안, 신선하게 준비된 수지와 1대 2 비율로 소실렌 산화물을 혼합하고 두 솔루션모두에 3%의 가속기를 추가합니다. 두 번째 프로필렌 옥사이드 인큐베이션 후, 실온에서 2시간 동안 1-2 수지 프로필렌 옥사이드 방류 매체 용액으로 샘플을 옮기고, 실온에서 1대 1 수지 프로필렌 옥사이드 에 2시간 배양한다.
두 번째 인큐베이션이 끝나면 조직을 평평한 폴리프로필렌 접시로 옮기고, 65~85°C에서 12~24시간 동안 3%의 가속기를 함유한 신선한 수지로 내장된 조직을 치료한다. 그런 다음 조직을 실온으로 식히고 폴리 프로필렌 접시에서 수지 임베디드 표본을 제거합니다. 관심 영역을 매핑하려면 이전에 준비된 이미지 아틀라스에서 관심 영역이 포함된 이미지를 선택합니다.
관심 영역의 테두리를 단면 된 이미지에 스케치하고, 현미경 아래 임베디드 시편에 이러한 테두리를 광학적으로 중첩시키고, 1 인치 26 게이지 바늘을 사용하여 이러한 영역테두리를 수지 시편에 긁어. 그런 다음 수지의 부드러워지기 위해 표본을 섭씨 95도로 가열합니다. 다음으로, 오븐에서 따뜻한 수지 표본을 꺼내서 면도날을 사용하여 관심 영역을 소비합니다.
표본을 적절한 구경의 막대를 들고 있는 아크릴 유리에 접착하고, 반및 초박형 단면에 장착된 시편을 다듬습니다. 초미세토메를 사용하여 반박형 0.7마이크로미터 및 초박형 70나노미터 섹션을 획득하여 유리 캐리어의 반박형 섹션과 니켈 그리드의 초박형 섹션을 수집합니다. PBS에서 1%Toluidine 블루로 반박형 부분을 4분 동안 염색한 다음, 빛 현미경으로 단면을 검사하기 전에 탈이온화된 물에 여러 개의 세설이 뒤따릅니다.
초박형 단면은 추가 수정 없이 180킬로볼트에서 전염 전자 현미경 검사법에 의해 직접 평가될 수 있다. 단면 후, 조직 조각은 방금 입증 된 것처럼 텔레 매크로 사진으로 이미지됩니다. 미루와 에탄올 침지 후, 단면도는 간섭 라이트 텔레 맥로그래피에 의해 다시 이미지화되어 각 조직 표면에 대해 특별히 색이 지정된 패턴을 드러냅니다.
추가 탈수 및 수지 포함 후, 관심 영역을 선택하고 전송 전자 현미경 검사법을 위해 추가 처리됩니다. 해마와 소뇌에서, 이끼 섬유 시냅스는 큰 사전 시냅스 부폰을 포함하여 다른 시냅스에 비해 독특한 초구조적 특성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 그들의 단면 단면도에서, boutons는 소포와 미토콘드리아의 광대 한 수를 포함하고, 아주 수시로 몇몇 수지상 척추를 둘러싸는.
척수에서 등쪽 푸니큘러스에는 올리고드렌드로글리아가 골수화한 많은 축산 섬유가 들어 있습니다. 대지 섹션에서는 척수의 두 후불 뿔 사이에서 등색 성균을 찾을 수 있습니다. 전송 전자 현미경 이미지에서 단면 된 골수화 축축이 둥글게 나타나고 축을 둘러싼 myelin 칼집이 라멜라에서 구성됩니다.
제조된 아틀라스 및 초구조 파라미터의 미세지형 투과 전자 현미경 이미지는 다양한 치료 조건 하에서 상이한 부분의 형태학적 신경가소성의 비교뿐만 아니라 동일한 영역 내의 파라미터 간의 비교에도 도움이 된다. 자궁 에서 자궁 트랜스듀션을 시작하기 전에 철저히 계획하고 준비해야 하며, 합병증이 있을 경우 재료와 계측기의 백업을 해야 합니다. 우리의 방법에 따라, 관심의 정의 된 분자의 초구조 추적을 위한 전자 현미경 검사전에 면역 금 라벨링과 같은 다른 기술을 추가 할 수 있습니다.
전체 유기체의 전체론적 보기로 시작하여 분자 지형을 향해 확대, 우리는 연구하고 조직 기능과 형태 사이의 관계를 조작 할 수 있습니다. 오스뮴 테트옥사이드는 위험합니다. 이 시약으로 작업 할 때 항상 후드 아래에서 작동하고 보호 안경과 손 장갑을 착용해야합니다.
