Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Este método se puede utilizar para analizar especies celulares reactivas de oxígeno en células adherentes con solo un microscopio de fluorescencia, y cuantificar la intensidad reactiva de las especies de oxígeno con lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable. Comience por sembrar dos veces 10 a la quinta células de cáncer colorrectal HCT116 en DMEM en cada pozo de una placa de 24 pozos.

Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, sustituya el medio de cultivo por 100 sulfatos ferrosos micromolares, o 10 medios micromolares que contengan doxorubicina, e incubar la placa durante otras 24 horas. Prepare la solución DCFH-DA disolviendo 4,85 miligramos de DCFH-DA en un mililitro de DMSO para hacer una solución de stock de 10 milimolar.

Justo antes de añadirlo a los pozos, diluir el caldo con DMEM precalentó para hacer una solución de trabajo de 10 micromolares, y vórtice durante 10 segundos. Para manchar las células, retire el medio que contiene el medicamento y lávelos una vez con DMEM. Agregue 500 microlitros de solución de trabajo DCFH-DA en cada pozo e incubar la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Después de la incubación, retire el DCFH-DA de los pozos, y lávelos dos veces con DMEM, y una vez con PBS. A continuación, agregue 500 microlitros de PBS a cada pozo. Utilice el canal de proteína fluorescente verde en el microscopio de fluorescencia para tomar imágenes representativas de las células.

A continuación, retire el PBS y agregue 200 microlitros de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación a cada pozo. Incubar la placa sobre hielo durante cinco minutos y recoger los lysates celulares en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 21, 130 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, transfiera 100 microlitros del sobrenadante a una placa negra de 96 pozos. Utilice un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros, y una longitud de onda de emisión de 530 nanómetros, para medir la fluorescencia en cada pozo. A continuación, mida la concentración de proteínas con el ensayo Bradford transfiriendo un microlitro del sobrenadante a una placa clara de 96 pozos con 100 microlitros de solución de ensayo de proteínas.

Utilice las concentraciones de proteínas para normalizar las intensidades de fluorescencia. Las células cancerosas colorrectales HCT116 fueron tratadas con 100 sulfatos ferrosos micromolares, o 10 doxorubicina micromolares, para el estrés oxidativo inductor. Como era de esperar, la fluorescencia verde se incrementó dramáticamente con ambos tratamientos.

Para cuantificar los cambios de intensidad relativa, las células se normalizaron y normalizaron con concentraciones de proteínas. La intensidad relativa de fluorescencia se incrementó significativamente por sulfato ferroso o doxorubicina. Al realizar este procedimiento, es importante hacer que la solución DCFH-DA sea fresca y evitar la exposición a la luz, así como minimizar la perturbación del estado celular, y realizar un lavado extenso de PBS justo antes de tomar la imagen.

Además de la detección del ROS total por este protocolo, específicamente ROS como peróxido se puede realizar.