Este trabajo está financiado por el Wellcome Trust, el Consejo de Investigación Médica, de la Royal Society, Birmingham Science City y la confianza que la infertilidad de Investigación. Nos gustaría agradecer la asistencia de expertos de la investigación Cairn en la construcción y la integración de los equipos de imágenes.

El esperma de los machos fértiles sanos, con un análisis de semen normal, normalmente se preparan para obtener imágenes de la siguiente manera. <ol><li> Las muestras de semen se almacenan a 37 ° C durante no más de 30 min. Las células son aisladas del plasma seminal de desplazarse hacia el interior complementado Earle solución salina balanceada (sEBSS; mM: 1.8 de CaCl 2 .2 H 2 O, 5.37 KCl, 0,81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26,2 NaHCO3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, NaCl 116,4, 55,6 D-glucosa, piruvato 2,73 Na, Na 41,8 lactato) suplementado con 0,3% de carbón de-lipidated/fatty ácido libre Fracción V de BSA (la calidad de la BSA es crucial para el éxito de la capacitación de los espermatozoides). 1 ml de sEBBS se pipeta en cada uno de una serie de tubos de 5 ml y suavemente underlayered con 0,3 ml de semen. Después de la incubación durante 1 hora (37 ° C, 6% de CO 2) de la parte superior de 0,7 ml se quita suavemente de cada tubo y se agruparon. 10 l de la suspensión de esperma se diluye con 90 l de 1% (v / v) de formol para inmovilizar las células, los espermatozoides son contados en una cámara Neubauer. La densidad de células en la suspensión se ajusta (con sEBSS) a 6 millones de células / ml. </li><li> La muestra se divide en partes alícuotas de 200 l en tubos sin apretar con tapa y se incubaron (37 ° C, 6% de CO 2) en durante 5-6 horas para permitir la capacitación. </li><li> Cubreobjetos (22x50 mm) han sido tratados previamente con poli-D-lisina. 10 l de poli-D-lisina solución (10% w / v) se aplica como una serie de pequeñas gotas en el centro del cubreobjetos. La poli-D-lisina se deja secar al aire. Esto puede ser en un escenario calentado y se debe a la desecación completa. Un cubreobjetos se adjunta con grasa de vacío de un espacio cerrado, construido, cámara de perfusable, policarbonato imagen (dimensiones 35 mm x 20 mm x 5 mm, capacidad de ≈ 180 l). Similar a la cámara Warner RC20 La poli-D-lisina cubreobjetos recubiertos forma la base de la cámara cuando las células se ven en un microscopio invertido y un 12 mm de diámetro circular cubreobjetos forma la superficie superior de la cámara, que permite la transmisión de la luz. </li><li> Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) o calcio Verde 1-AM se utilizan para las células de etiquetado. OGB se prepara disolviendo en DMSO. Pluronic F127 ácido (un detergente) está incluido en el DMSO para evitar el &quot;agrupamiento&quot; de la tintura. Esto puede ser preparado en el laboratorio (100 Pluronic mg en 0,5 ml de DMSO), inmediatamente antes de su uso, o se pueden comprar ya preparadas. 20 l se añade a una alícuota de 50 g de OGB (2,5 mg / ml). El vial se pueden almacenar congelados y descongelados para su uso posterior. </li><li> Después de la capacitación de los espermatozoides (5-6 h en sEBBS, 37 ° C, 6% de CO 2) se selecciona un tubo de imagen y 1,2 l de solución de OGB se añade, dando una concentración final de 10 mM. El tubo se incuba durante 40 min, tras lo cual la suspensión celular se inyecta suavemente en el puerto de entrada de la cámara de imágenes con un p1000 (azul) punta de la pipeta. La cámara se coloca en el lado del cubreobjetos incubadora, poli-D-lisina abajo, durante 20 minutos. Las células tienden a nadar a lo largo de las superficies de la cámara y se adhiere a la zona de poli-D-lisina. </li><li> La cámara está montada en el microscopio, conectado con el aparato de perfusión y perfundidos a aproximadamente 0,5 ml / min. Una bomba de rodillo de alimentación de solución salina en la cámara y el desbordamiento de la puerta de salida se elimina mediante una bomba de aspiración con trampa. La preparación se deja en la oscuridad durante al menos 10 minutos mientras que las células sueltas y tinte extracelular se eliminan mediante la perfusión de la cámara. Estabilidad de la temperatura es muy importante porque las pequeñas fluctuaciones, no sólo puede afectar a células de Ca 2 + homeostasis, pero también puede afectar K d de la tintura. Los experimentos se realizan normalmente a 25 ° C, logra manteniendo la temperatura de la habitación a oscuras en este nivel. Hemos encontrado que el mantenimiento de la temperatura ambiente en el nivel requerido proporciona una mayor estabilidad de la temperatura y la concentración que utilizando una etapa de control de temperatura o un calentador con termostato en la entrada de solución salina. </li><li> Las células son examinadas bajo contraste de fase (40x o 60x de inmersión en aceite) objetivo y un área de imagen seleccionada. La porción de la superficie recubierta con poli-D-lisina que se encuentra cerca del puerto de entrada se prefiere, donde el flujo de solución salina es laminar y consistente. También es importante la utilización de una zona donde la densidad celular es el adecuado (densidad excesiva afecta la calidad y la integridad de los datos a través de la captación de la señal de las células adyacentes) y donde las células están debidamente conectados, pero la actividad flagelar es discernible. Una imagen de contraste de fase se guarda. El microscopio es entonces cambia al modo de fluorescencia (excitación 480 nm, emisión 540 nm) y el tiempo de exposición se reduce a la mínima requerida para obtener una imagen clara de fluorescencia (generalmente 50-200 ms). </li><li> El experimento se inicia con la activación del software de imágenes de series de tiempo de adquisición (IQ). Normalmente, las imágenes se adquieren a 0,1 Hz y la iluminación se limita a los períodos de adquisición de imágenes sólo con un software obturador controlado. Mucho mayores tasas de adquisición de imágenes se pueden utilizar, pero deberá tenerse en cuenta los problemas de la decoloración y la generación de artefactos debido a la foto-daño a las células (véase la discusión). IQ (y la mayoría de otras plataformas de software de adquisición) permitirá en tiempo real, gráficos de fluorescencia durante el experimento. </li><li> Después de un período de control de la manipulación de 3-5 minutos de duración de los componentes de solución salina (por ejemplo, [Ca 2 +] o) y la aplicación de los medicamentos se logra mediante el reemplazo de la solución salina en la cabecera de la perfusión. Momento de la adición de cada estímulo se observa lo que el tiempo de llegada en la cámara de imágenes se puede calcular, proporcionando la suficiente precisión para la evaluación de las respuestas lentas se describe aquí (muestra a 0,1 Hz). Para una respuesta más rápida una mayor precisión se puede lograr mediante la adición de estímulos directamente al flujo de solución salina a través de un puerto de entrada de segundo de lo dispuesto en la cámara de Warner RC20. </li><li> Las imágenes son analizadas en línea con el CI. Las regiones de interés (ROI) se extraen alrededor de cada celda (o parte de la célula) y también una zona libre de células se ha seleccionado (por sustracción automática de fondo por el software. La serie de imágenes se comprueba para eliminar las células que murieron o recibieron la reacción del acrosoma ( que aparece como un aumento importante y rápido en la fluorescencia seguida por la pérdida de colorante citoplasmática) durante el experimento y los que mostraron el movimiento suficiente para que los artefactos cuando se analiza como una serie de tiempo. </li><li> Una serie de tiempo-intensidad de fluorescencia se obtiene entonces para cada ROI y se analizan estos datos en línea en Excel. Inicialmente, la fluorescencia se normaliza al valor medio obtenido durante el período de control, usando la ecuación R = [(FF resto) / F resto] x 100%, donde R es el cambio en la fluorescencia% en comparación con el período de control, F es la intensidad de fluorescencia en un tiempo t y el resto F es la media de al menos 30 determinaciones de F obtenidos durante el período de control. </li></ol> Resultados representante La figura 1 muestra una serie de imágenes de un experimento en el que las células fueron estimuladas con progesterona M 3. En la fila superior y una película muestran las imágenes de fluorescencia en una escala de grises y los magos mismo se muestran a continuación (y en la película de 2) en pseudocolor (búsqueda &#39;16_colors mesa &quot;en la imagen J), donde &#39;cool&#39; de colores indican la intensidad de fluorescencia baja y &quot;caliente&quot; colores indican la intensidad de fluorescencia de alta. Las células se pueden ver en pseudocolor durante el experimento, utilizando tablas de consulta en el coeficiente intelectual, pero usando la escala de grises en general es más informativo para evaluar. Si las células están bien etiquetados. Las dos primeras imágenes se obtuvieron a 0 s y s 100 después de comenzar la grabación. Fluorescencia debe ser estable y tiende a ser más fuertes en la zona posterior del cuello y acrosomal de espermatozoides. La progesterona entró en la cámara de imágenes a unos 175 s, y la 3 ª y 4 ª imagen (180 s, y s 220) muestra un rápido aumento de [Ca 2 +] i (fluorescencia), originarios de posterior de la cabeza y el cuello de la célula. Las imágenes siguientes son de 290, 360, 740, 990 y 1440 s, mostrando la decadencia de la inicial [Ca 2 +] i transitorios y el desarrollo de una elevación sostenida secundaria. La figura 2 muestra un análisis de hojas de cálculo, la conversión de crudos valores de fluorescencia para cada ROI de fluorescencia normalizada (% de cambio en la fluorescencia en comparación con el período de control) La figura 3 muestra normalizada tiempo-parcelas de fluorescencia de 3 celdas que muestra &quot;típico&quot; de las respuestas a la progesterona M 3. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Datos de ejemplo de una célula estimulada con progesterona. Una serie de imágenes de fluorescencia en la escala de grises (fila superior) y pseudocolor (fila inferior) se muestran. Momentos son 0, 180, 220, 290, 360 y 990. 3 progesterona M entró en la cámara de imágenes a 175 s. Rendimiento de la inversión se muestran en el primer panel. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Análisis de datos única de fluorescencia de células en Excel. Las cifras en negro son series temporales de datos de fluorescencia, de forma vertical. Las cifras en rojo (abajo) son los datos normalizados obtenidos utilizando la ecuación dada en el texto. El gráfico muestra la normalización de fluorescencia en tiempo parcela de 64 células en este experimento que, a la estimulación, muestra un aumento transitorio de la fluorescencia seguida por un aumento lento y una serie de pequeñas oscilaciones. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Fluorescencia a tiempo las huellas de tres celdas individuales, expresado en% de variación con respecto al control de valor .. 3 progesterona M se añadió en el tiempo marcado por la flecha. De puntos muestra la línea media de fluorescencia de control.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

Cuando se lleva a cabo con éxito, esta técnica permite la grabación de la distribución y la cinética de espontánea e inducida de Ca 2 + señales en el esperma humano. Las respuestas pueden ser obtenidos a partir de un gran número de células (hasta 200) lo cual es importante ya que el esperma humano puede mostrar una gran variación en su espontánea y estimulada Ca 2 + señales. Etiquetado de éxito y supervivencia de las células durante la grabación dependen en gran medida la calidad de la muestra. Muestras pobres dan etiquetado deficiente, las respuestas de los pobres y las células pueden morir durante la grabación. Los espermatozoides humanos son muy sensibles a la foto-daño y por lo tanto, el uso de la iluminación mínima necesaria (tanto en intensidad y tiempo de exposición) con el fin de maximizar la supervivencia de las células y reducir al mínimo los artefactos debido a la muerte celular. Una cámara de alta sensibilidad (que permite el uso de la iluminación de baja intensidad) es un gran beneficio ya que la cámara tomará la fluorescencia débil. Retroiluminado, EM-CCD cámaras están particularmente bien adaptado, aunque muy caro. La iluminación por LED (en lugar de utilizar una lámpara de mercurio o de xenón, con filtro de excitación también mejora la supervivencia de las células (Nishigaki et al, 2006). Nosotros no usamos Fura-2, a pesar de las evidentes ventajas de la relación de la métrica de imagen, ya que requiere Fura excitación con luz ultravioleta, y porque es necesario tomar dos imágenes para cada relación. Por los datos obtenidos con la longitud de onda única, tintes de luz visible, la normalización de la intensidad de fluorescencia en gran medida compensa la diferencia en la carga de tintes entre las células, pero no para la distribución de medio de contraste dentro de una celda individual, y esto debe tenerse en cuenta. A pesar de los tintes sola longitud de onda puede, en principio, ser calibrado, la precisión de la técnica es pobre y que no intente hacer esto. Considerando que la relación de los datos obtenidos con Fura-2 (o la emisión relación tinte indo), aún sin calibración, dar una representación aceptable fiel de los cambios relativos en el [Ca 2 +] i, la intensidad de fluorescencia de los tintes sola longitud de onda está lejos de ser lineal relacionados con la [Ca2 +] i. Sobre la parte más útil de la curva de saturación de la relación de tintes sola longitud de onda por lo general se aproxima a la logarítmica. En la actualidad utilizamos Oregon Green BAPTA-1 (Figura 4), ​​ya que es sensible a pequeños cambios en la [Ca 2 +] i en reposo cerca de nivel s (50-100 nm). Cuando la [Ca2 +] i se eleva por encima de 1 mM respuestas serán representadas en términos de cambio de fluorescencia y el colorante pueden saturar. Una opción para la mejora de la técnica sin tener que recurrir a la excitación UV es duplicar las células de carga con un tinte como Fluo-3 y el rojo Fura. Ambos se pueden excitar a 488 nm, pero simultáneamente sus respuestas son muy diferentes. Grabación de la emisión a 540 y 650 Nm proporciona una relación que puede proporcionar un mejor método para un control preciso de la [Ca2 +] i (Haughland, 2002) y puede ser aplicable a los espermatozoides (Nisigaki et al, 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Relación entre la libre [Ca 2 +] (nm) y de emisión de fluorescencia en el pico de longitud de onda (aproximadamente 525 nm) de Oregon Green BAPTA-1 y Oregon Green BAPTA-2. OGB1 da una mayor fluorescencia en reposo [Ca 2 +], pero se satura en los niveles inferiores y por lo tanto tiene un menor rango utilizable. Los datos de estas parcelas se obtuvieron de Molecular manual de sondas (Haughland, 2002).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

Microscopía de fluorescencia de células cargadas con fluorescentes, Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibles a tintes se utiliza para la medición de los aspectos espaciales y temporales de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Señalización en las células vivas. A continuación se describe el método utilizado en nuestros laboratorios para la carga de las suspensiones de espermatozoides humanos con Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-La presentación de informes tintes y la medición de la señal de fluorescencia durante la estimulación fisiológica. Células móviles están aislados por contacto directo de la piscina y se incubaron en condiciones de Capacitación para 0-24 h, dependiendo del experimento. La célula-permeable AM ​​(acetoxi éster metílico) éster forma de la Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-La presentación de informes colorante se añade a una alícuota de las células y un período de 1 h es permitido para la carga de la tinta en el citoplasma. Usamos tintes visible de longitud de onda para reducir al mínimo la foto-daño a las células, pero esto significa que la grabación radiométrica no es posible. Ventajas y desventajas de este enfoque se tratan. Durante el período de las células de carga se introducen en una cámara de imágenes y permite que se adhieran a un cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina. Al final de la tintura período de exceso de carga y células sueltas se eliminan mediante la conexión de la cámara al aparato de perfusión. La cámara está perfundida continuamente, los estímulos y las salinas modificado se añaden a la cabecera de la perfusión. Los experimentos se registran por la adquisición de lapso de tiempo de imágenes de fluorescencia y analizan en detalle en línea, de forma manual de dibujo de regiones de interés. Los datos se normalizan los niveles de pre-estímulo de tal manera que, para cada celda (o parte de una célula), una gráfica que muestra el Ca<sup&gt; 2 +</supRespuesta&gt; como% de cambio en la fluorescencia se obtiene.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm at JoVE.com

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Estímulo evocado [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] I las señales de los espermatozoides humanos individuales se evalúan. Células móviles se cargan con Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibles tinte fluorescente (AM-éster método) e inmovilizados en una cámara de perfusable. Las células son fotografiadas por microscopía de fluorescencia time-lapse y estimulado por el medio de perfusión. Las respuestas de las células individuales (o regiones) se analizan en línea con Excel.

Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K vistas.  University of Birmingham. Estímulo evocado [Ca 2 +] I las señales de los espermatozoides humanos individuales se evalúan. Células móviles se cargan con Ca 2 + Sensibles tinte fluorescente (AM-éster método) e inmovilizados en una cámara de perfusable. Las células son fotografiadas por microscopía de fluorescencia time-lapse y estimulado por el medio de perfusión. Las respuestas de las células individuales (o regiones) se analizan en línea con Excel.

Video: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

En vivo Ca 2 + - Imágenes de las neuronas del cuerpo de hongos durante el aprendizaje olfativo en la abeja de la miel

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Investigación

Biología

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualización de Ca Vascular 2 + Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un alto contenido de imágenes de flujo de trabajo para estudiar Grb2 complejos de señalización por clonación de expresión

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitorios y corrientes de membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Medición de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo<em&gt; Drosophila</emLos ovocitos&gt;

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...