El objetivo de estos procedimientos es evaluar la integridad de las membranas espermáticas utilizando sondas fluorescentes específicas combinadas con microscopía de fluorescencia o análisis de citometría de flujo. Estas técnicas podrían ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción, como la predicción del potencial de fertilización y la calidad de la muestra de espermatozoides. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten una evaluación precisa de múltiples membranas espermáticas que se sabe que se asocian con el potencial de fertilización de espermatozoides.
Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia el diagnóstico de la calidad de la eyaculación, ya que permite una evaluación más precisa del plasma esperma y la integridad de la membrana acrosoma, así como el potencial de la membrana mitocondrial. Para comenzar este procedimiento, obtenga aproximadamente de uno a seis mililitros de semen de toro en un tubo de 15 mililitros a temperatura ambiente. Agregue seis mililitros de tampón NKM precalentados a 37 grados centígrados a cada mililitro de semen.
Centrifugar a 600 veces g durante ocho minutos. Repita la centrifugación una o dos veces hasta que el sobrenadante esté limpio. Después de esto, deseche inmediatamente la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente un centímetro de sobrenadante por encima del pellet.
Incline cuidadosamente los tubos en un ángulo de 30 grados en la incubadora y espere de 20 a 30 minutos para permitir que los espermatozoides naden hacia arriba. Usando una micropipeta, retire cuidadosamente el mililitro restante de sobrenadante que ahora contiene el espermatozoide móvil y transfiéralo a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Mantenga el esperma a 37 grados Celsius hasta que esté listo para usar.
En primer lugar, prepare todas las soluciones de stock necesarias como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera 133 microlitros de los espermatozoides móviles a una concentración de 25 millones de espermatozoides por mililitro a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añadir 17 microlitros de la solución de trabajo DAPI e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Centrifugar a 1.000 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 100 microlitros de tampón NKM al pellet. A continuación, añada 50 microlitros de FITC-PSA, dos microlitros de JC-1 y tres microlitros de PI. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Centrifugar a 1.000 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 microlitros de tampón NKM. A continuación, transfiera 10 microlitros de la muestra a un portaobjetos de vidrio.
Difuminar la muestra y añadir un cubreobjetos. Después de esto, comience inmediatamente a visualizar la muestra por microscopía de epifluorescencia con un objetivo 40X y un filtro triple como se describe en el protocolo de texto, utilizando una cámara digital para capturar una imagen separada para cada filtro. Utilice la opción de fusión en el software de la cámara para combinar las tres imágenes recibidas de los filtros, guardando el nuevo archivo en formato JPEG.
Abra la imagen combinada con la herramienta de pintura y utilice la opción de pincel para marcar el espermatozoide. A continuación, clasificar los espermatozoides en función de la fluorescencia emitida por cada sonda, asegurándose de evaluar al menos 200 espermatozoides por diapositiva. Todas las celdas deben aparecer azules desde el DAPI.
Contar las células muertas, que parecen púrpuras, para evaluar la viabilidad. A continuación, utilice los patrones de tinción de fluorescencia para evaluar el estado del acrosoma. Por último, evaluar el potencial de la membrana mitocondrial mediante la distinción de los espermatozoides con alto potencial de membrana mitocondrial que exhiben una mitad teñida de rojo de los espermatozoides con bajo potencial de membrana mitocondrial que exhiben una mitad teñida de verde.
Cuente las piezas medias rojas y verdes por separado y calcule su relación. Para comenzar la evaluación de la integridad de la membrana plasmática, tome el número deseado de pozos del kit de viabilidad y concentración. Transfiera los pozos a la base de trabajo y cúbralos con una tapa flexible para protegerlos de la luz.
Añadir 199 microlitros de solución tamponada para la citometría a cada pozo. Luego agregue un microlitro de semen homogéneo a una concentración de 57 millones de células por mililitro a cada pozo y homogeneizar por pipeteo. Cubra la placa con la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Después de esto, ejecute la muestra a través del citometro de flujo utilizando el ajuste de viabilidad. Para comenzar a evaluar el potencial de la membrana mitocondrial, saque el número deseado de pozos del kit de actividad mitocondrial. Transfiéralos a la base de trabajo.
Añadir 10 microlitros de etanol absoluto a cada pozo y utilizar una pipeta para resuspender el polvo presente dentro del pozo. Añadir 190 microlitros de PBS por pozo y homogeneizar por pipeteo. Añadir 0,75 microlitros de semen homogéneo a una concentración de 57 millones de células por mililitro a cada pozo y homogeneizar mediante pipeteo.
Cubra la placa con la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, ejecute la muestra a través del citometro de flujo utilizando el ajuste de actividad mitocondrial. Para comenzar a evaluar la integridad de la membrana acrosomal, saque el número deseado de pozos del kit de viabilidad e integridad acrosome.
Transfiera los pozos a la base de trabajo y cúbralos con una tapa flexible para protegerlos de la luz. Añadir 200 microlitros de solución almacenada en búfer para la citometría a cada pozo. Luego agregue 0,7 microlitros de semen homogéneo a una concentración de 57 millones de células por mililitro a cada pozo y homogeneizar por pipeteo.
Cubra la placa con la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 45 minutos. Después de esto, ejecute la muestra a través del citometro de flujo utilizando la configuración de información. En este estudio, la calidad del semen se evalúa utilizando diferentes técnicas, una de las cuales evaluó las membranas espermáticas utilizando sondas fluorométricas.
Es posible evaluar las diferencias en la calidad de la muestra de espermatozoides en términos de integridad de la membrana. Por ejemplo, la eyaculación del toro número siete tenía un porcentaje relativamente bajo de células muertas, una baja proporción de espermatozoides con acrosoma pseudo-reaccionado y un mayor potencial de membrana mitocondrial en comparación con la eyaculación del toro número uno. A continuación, se evalúan las muestras para detectar la viabilidad y la actividad mitocondrial.
Los histogramas de estos ejemplos representativos representan los espermatozoides no cerrados y los desechos y los espermatozoides cerrados. Estos histogramas también representan las células viables y muertas y la distribución de espermatozoides a membrana mitocondrial polarizada y despolarizada. La integridad del acromos se evalúa con un kit listo para usar y se lee con citometría de flujo, dividiendo el área en tres áreas marcadoras que representan células fluorescentes bajas insignificantes con acrooma intacto no manchado, células fluorescentes bajas con parte residual manchada del acrooma, y células altamente fluorescentes con acrooma alterado.
Al intentar estos procedimientos, es importante asegurarse de preparar correctamente la muestra inicial de espermatozoides. Estas técnicas pueden proporcionar información sobre la evaluación de la calidad de los espermatozoides y se pueden aplicar a diversos organismos como bovino, aves de corral y humanos. La comparación entre las dos técnicas, la tinción cuádruple y la citometría de flujo indicaron que no había diferencias significativas para la viabilidad, el potencial de membrana mitocondrial y la integridad del acrooma que revelaba que las dos técnicas producían resultados coincidentes.
