Este modelo de mucositis inducida por quimioterapia se puede utilizar para determinar puntos finales importantes y marcadores proliferados de pequeñas lesiones intestinales e hiperproliferación compensatoria en ratones. Este método es de tiempo y costo eficiente y fácil de llevar a cabo. Con un método estandarizado como este, es más fácil comparar puntos finales analíticos con pocas variaciones.
Para la inducción de mucositis de 5-Florauraci o 5FU, cargue una jeringa de 1 mililitro equipada con una aguja de calibre 27 por 19 milímetros con el volumen adecuado de 5FU y retenga manualmente un ratón receptor. Mientras mantiene el ratón en un agarre firme pero suave, exponga el lado ventral del animal e inserte la aguja en la cavidad intraparitoneal dentro de uno de los cuadrantes inferiores del abdomen. A continuación, aspirar para asegurar la colocación adecuada de la aguja e inyectar el 5FU.
En el punto final experimental apropiado, 4-Bromo-Deoxyuridine o cuantificación BrdU, pesar un ratón animal lesionado 5FU y entregar 5 miligramos por kilogramo de BrdU por inyección intraperitoneal en una campana de humo. 150 minutos después de la injeción de brdU, confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, registrar el peso del ratón anestesiado, y colocar el animal en la posición supina. Realizar una laparotomía para exponer la cavidad abdominal y hacer una incisión de la cavidad torácica para introducir neumotórax.
Cortar superior al píloro, y extraer cuidadosamente retraer el tejido intestinal lejos del animal hasta que se alcanza el cecum. Usando fórceps, sujeta suavemente el lumen proximal y usa una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 25 para lavar el intestino delgado con solución salina. A continuación, coloque el intestino vaciado sobre papel de hinchazón limpio para eliminar cuidadosamente el exceso de solución de sal.
Para la recolección de tejido, cosechar el intestino delgado del animal inyectado como se acaba de demostrar y registrar el peso del tejido enrojecido. Después del procesamiento histológico, el tejido se puede tomar imágenes bajo el objetivo 10x de un microscopio de luz conectado a una cámara para obtener fotos histológicas del tejido cosechado. Para medir el área de las células inmunorreactivas BrdU, abra la imagen de interés en la imagen J y abra la imagen del micrómetro de escenario.
Utilice la herramienta de selección de línea recta para dibujar una línea recta en la imagen de micrómetro para definir una distancia conocida y seleccionar la escala de conjunto en el menú de análisis. Introduzca un valor en el cuadro de distancia conocida y defina la unidad de longitud en el cuadro de unidad de longitud. Abra una imagen de interés para medir el área de las celdas inmunorreactivas BrdU por cripta y establezca los gráficos de color en 8 bits en el menú de tipo de imagen.
Aumente el contraste de la imagen en contraste mejorado por el proceso y establezca los píxeles saturados en 0,4%Aplicar un umbral a la imagen para segmentar la inmuno-positividad y seleccionar el ajuste de imagen. Seleccione umbral y rojo, moviendo la barra de umbral para seleccionar un umbral de alrededor del 10 al 20 por ciento. A continuación, seleccione una cripta bien orientada y utilice la herramienta de selección a mano alzada para marcar el área alrededor de ella.
Para medir el área de umbral, abra la pestaña Analizar y seleccione Analizar partículas. En la ventana analizar partícula, establezca el tamaño en 20 a infinito y haga clic en las unidades de píxeles del cuadro. Establezca la circularidad en cero en uno y establezca show en contornos.
A continuación, haga clic en los cuadros de resultados de visualización, resumen e incluir taladros. Los resultados de la medición se mostrarán en la ventana de resumen. Para medir la profundidad de la cripta, abra una imagen en Zen Light y conéctese a la cámara.
Tome instantáneas en modo de cámara con un objetivo de 20x y cambie al modo de procesamiento para abrir la instantánea. Cambie a la vista de medida. Utilice la herramienta de líneas para iniciar una línea en la parte inferior de una cripta bien orientada, terminando la línea en la parte superior de la cripta.
A continuación, exporte las mediciones y calcule el promedio de la profundidad de la cripta y el relleno como altura. El peso del intestino delgado disminuye desde el día 2 hasta el día 4, lo que sugiere una pérdida en la masa de enterocitos. Cabe destacar que para el día 5, el peso no es significativamente diferente del peso del día 0 en los animales tratados.
La proliferación medida por la incorporación de BrdU está casi abolida en los días 1 y 2, pero en los días 4 y 5, hay aproximadamente cuatro y cinco veces en su proliferación, respectivamente. Esta hiperproliferación también se observa al medir la profundidad de la cripta. En la fase regenerativa de la mucositis, existe una fuerte correlación entre la incorporación de BrdU y la profundidad de la cripta que no se observa durante la fase aguda, lo que sugiere que el uso de la profundidad de la cripta como punto final podría ser adecuado en la fase aguda de la mucositis.
Los ratones transgénicos, con una secreción insuficiente de células L, demuestran una pérdida significativa de peso corporal y una disminución en el peso del intestino delgado en la fase de recuperación, en comparación con la observada en ratones salvajes de tipo 5-FU. Además, los ratones transgénicos no muestran hiperproliferación compensatoria, ya que las criptas son significativamente más cortas que en ratones de tipo salvaje y controles saludables. Al intentar este procedimiento, asegúrese de vaciar completamente el intestino delgado y eliminar el exceso de solución salina antes de pesar el tejido para obtener el peso intestinal pequeño solamente.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo conducir, recoger y determinar puntos finales importantes de pequeñas lesiones intestinales. Y para obtener efectivamente datos reproducibles. No olvide que trabajar con compuestos químicos como 5FU y BrdU puede ser peligroso y que las precauciones, como el uso de una bata de laboratorio, guantes y una campana de humo siempre deben tomarse al realizar estos procedimientos.
