Este modelo de mucosite induzida pela quimioterapia pode ser usado para determinar pontos finais importantes e marcadores proliferados de pequenas lesões intestinais e hiperproliferação compensatória em camundongos. Este método é tempo e custo-benefício e fácil de realizar. Com um método padronizado como este, é mais fácil comparar pontos finais analíticos com poucas variações.
Para indução de mucosite de 5-Florauracil ou 5FU, carregue uma seringa de 1 mililitro equipada com uma agulha de 27 por 19 milímetros com o volume apropriado de 5FU e contenha manualmente um mouse receptor. Mantendo o camundongo em uma pegada firme, mas suave, exponha o lado ventral do animal e insira a agulha na cavidade intraparitoneal dentro de um dos quadrantes inferiores do abdômen. Em seguida, aspire para garantir a colocação adequada da agulha e injetar o 5FU.
No ponto final experimental apropriado, 4-Bromo-Deoxyuridine ou quantificação brdU, pesar um rato animal ferido 5FU e entregar 5 miligramas por quilograma de BrdU por injeção intraperitoneal em um capô de fumaça. 150 minutos após a injeção da BrdU, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo, regisine o peso do rato anestesiado e coloque o animal na posição supina. Faça uma laparotomia para expor a cavidade abdominal e fazer uma incisão da cavidade torácica para introduzir pneumotórax.
Corte superior ao pilório, e extraia cuidadosamente retrair o tecido intestinal do animal até que o ceco seja atingido. Usando fórceps, fixar suavemente o lúmen proximal e usar uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 25 para lavar o intestino delgado com soro fisiológico. Em seguida, coloque o intestino esvaziado em papel de mancha limpa para remover cuidadosamente a solução de sal em excesso.
Para a coleta de tecidos, retire o intestino delgado do animal injetado como apenas demonstrado e registre o peso do tecido corado. Após o processamento histológico, o tecido pode ser imageado sob o objetivo de 10x de um microscópio leve conectado a uma câmera para obter fotos histológicas do tecido colhido. Para medir a área das células imunoreativas da BrdU, abra a imagem de interesse pela imagem J e abra a imagem do micrômetro do palco.
Use a ferramenta de seleção em linha reta para desenhar uma linha reta na imagem de micrômetro para definir uma distância conhecida e selecionar escala definida no menu analisar. Digite um valor na caixa de distância conhecida e defina a unidade de comprimento na unidade da caixa de comprimento. Abra uma imagem de interesse para medir a área das células imunoreativas brdU por cripta e defina os gráficos de cor para 8 bits sob o menu do tipo de imagem.
Aumente o contraste da imagem em contraste aprimorado pelo processo e defina os pixels saturados para 0,4% Aplique um limiar à imagem para segmentar a imuno positividade e selecionar ajuste de imagem. Selecione limiar e vermelho, movendo a barra de limiar para selecionar um limiar de cerca de 10 a 20%. Em seguida, selecione uma cripta bem orientada e use a ferramenta de seleção à mão livre para marcar a área ao seu redor.
Para medir a área de limiar, abra a guia de análise e selecione analisar partículas. Na janela de partículas de análise, defina o tamanho para 20 para o infinito e clique nas unidades de pixels da caixa. Defina a circularidade para zero a um, e defina mostrar contornos.
Em seguida, clique nos resultados do display, resumir e inclua caixas de furos. Os resultados da medição serão exibidos na janela de resumo. Para medir a profundidade da cripta, abra uma imagem no Zen Light e conecte-se à câmera.
Tire instantâneos no modo câmera com um objetivo de 20x e mude para o modo de processamento para abrir o snapshot. Mude para a visão de medida. Use a ferramenta de linha para iniciar uma linha na parte inferior de uma cripta bem orientada, terminando a linha na parte superior da cripta.
Em seguida, exporte as medidas e calcule a média da profundidade da cripta e preencha como altura. O peso do intestino delgado diminui do dia 2 até o dia 4, sugerindo uma perda na massa de enterócito. Note-se que, até o dia 5, o peso não é significativamente diferente do peso do dia 0 em animais tratados.
A proliferação medida pela incorporação da BrdU é quase abolida nos dias 1 e 2, mas nos dias 4 e 5, há aproximadamente quatro e cinco vezes aumentos em sua proliferação, respectivamente. Essa hiperproliferação também é observada ao medir a profundidade da cripta. Na fase regenerativa da mucosite, há uma forte correlação entre a incorporação de BrdU e a profundidade da cripta que não é observada durante a fase aguda, sugerindo que o uso da profundidade da cripta como ponto final pode ser adequado na fase aguda da mucosite.
Camundongos transgênicos, com uma secreção insuficiente de células L, demonstram uma perda significativa de peso corporal e uma diminuição do peso do intestino delgado na fase de recuperação, em comparação com o observado em camundongos wild tipo 5-FU. Além disso, os camundongos transgênicos não apresentam hiperproliferação compensatória, pois as criptas são significativamente mais curtas do que em camundongos do tipo selvagem e controles saudáveis. Ao tentar este procedimento, certifique-se de esvaziar completamente o intestino delgado, e remover o excesso de soro fisiológico antes de pesar o tecido para obter o pequeno peso intestinal apenas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir, coletar e determinar pontos finais importantes de pequenas lesões intestinais. E para obter efetivamente dados reprodutíveis. Não se esqueça que trabalhar com compostos químicos como 5FU e BrdU pode ser perigoso e que precauções, como o uso de um jaleco, luvas e um capuz de fumaça devem ser sempre tomadas na realização desses procedimentos.
