Questo modello di mucosite indotta dalla chemioterapia può essere utilizzato per determinare endpoint importanti e marcatori proliferati di piccole lesioni intestinali e iperproliferazione compensativa nei topi. Questo metodo è efficiente in termini di tempo e costi e facile da eseguire. Con un metodo standardizzato come questo, è più facile confrontare gli endpoint analitici con poche varianti.
Per l'induzione di mucosite 5-Florauracil o 5FU, caricare una siringa da 1 millilitro dotata di un ago da 27 per 19 millimetri con il volume appropriato di 5FU e trattenere manualmente un mouse ricevente. Pur mantenendo il mouse in una presa ferma ma delicata, esporre il lato ventrale dell'animale e inserire l'ago nella cavità intraparinare all'interno di uno dei quadranti inferiori dell'addome. Quindi, aspirare a garantire un corretto posizionamento dell'ago e iniettare il 5FU.
All'endpoint sperimentale appropriato, la quantificazione 4-bromo-deossiuridina o BrdU, pesare un topo animale ferito da 5FU e consegnare 5 milligrammi per chilogrammo di BrdU mediante iniezione intraperitoneale in una cappa aspirante. 150 minuti dopo l'iniezione di BrdU, confermare una mancanza di risposta al dito del piedi, registrare il peso del topo anestetizzato e posizionare l'animale in posizione supina. Eseguire una laparotomia per esporre la cavità addominale e fare un'incisione della cavità toracica per introdurre lo pneumotorace.
Tagliare superiore al piloro ed estrarre con cura ritrarre il tessuto intestinale lontano dall'animale fino a raggiungere il cieco. Utilizzando pinze, bloccare delicatamente il lume prossimale chiuso e utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 25 per lavare l'intestino tenue con soluzione salina. Quindi posizionare l'intestino svuotato su carta assorbente pulita per rimuovere con cura la soluzione di sale in eccesso.
Per la raccolta dei tessuti, raccogliere l'intestino tenue dall'animale iniettato come appena dimostrato e registrare il peso del tessuto lavato. Dopo l'elaborazione istologica, il tessuto può essere immaginato sotto l'obiettivo 10x di un microscopio luminoso collegato a una fotocamera per ottenere foto istologiche del tessuto raccolto. Per misurare l'area delle cellule immunoreattive BrdU, aprire l'immagine di interesse per l'immagine J e aprire l'immagine del micrometro dello stadio.
Utilizzate lo strumento di selezione linea retta per disegnare una linea retta sull'immagine del micrometro per definire una distanza nota e selezionare la scala impostata nel menu analizza. Immettete un valore nella casella distanza nota e definite l'unità di lunghezza nella casella unità di lunghezza. Aprite un'immagine di interesse per misurare l'area delle cellule immunoreattive BrdU per cripta e impostate la grafica a colori su 8 bit nel menu del tipo di immagine.
Aumentare il contrasto dell'immagine in contrasto migliorato dal processo e impostare i pixel saturi su 0,4%Applicare una soglia all'immagine per segmentare l'immuno-positività e selezionare la regolazione dell'immagine. Selezionare soglia e rosso, spostando la barra di soglia per selezionare una soglia di circa il 10-20%. Quindi selezionare una cripta ben orientata e utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per contrassegnare l'area circostante.
Per misurare l'area di soglia, aprite la scheda analizza e selezionate analizza particelle. Nella finestra analizza particella impostare la dimensione su 20 sull'infinito e fare clic sulle unità pixel della casella. Impostate la circolarità su zero su uno e impostate lo spettacolo sui contorni.
Quindi fare clic sui risultati dello schermo, riepilogare e includere caselle fori. I risultati della misurazione verranno visualizzati nella finestra di riepilogo. Per misurare la profondità della cripta, apri un'immagine in Zen Light e connettiti alla fotocamera.
Scatta istantanee in modalità fotocamera con un obiettivo 20x e passa alla modalità di elaborazione per aprire l'istantanea. Passare alla visualizzazione misura. Usa lo strumento linea per iniziare una linea nella parte inferiore di una cripta ben orientata, terminando la linea nella parte superiore della cripta.
Quindi esportare le misure e calcolare la media della profondità della cripta e riempire come altezza. Il peso dell'intestino tenue diminuisce dal giorno 2 al giorno 4, suggerendo una perdita nella massa enterocita. Naturalmente, entro il giorno 5, il peso non è significativamente diverso dal peso del giorno 0 sugli animali trattati.
La proliferazione misurata per incorporazione di BrdU è quasi abolita ai giorni 1 e 2, ma ai giorni 4 e 5, vi sono rispettivamente aumenti di circa quattro e cinque volte della loro proliferazione. Questa iperproliferazione si osserva anche quando si misura la profondità della cripta. Nella fase rigenerativa della mucosite, c'è una forte correlazione tra l'incorporazione di BrdU e la profondità della cripta che non si osserva durante la fase acuta, suggerendo che l'uso della profondità della cripta come endpoint potrebbe essere adatto nella fase acuta della mucosite.
I topi transgenici, con una secrezione insufficiente di cellule L, dimostrano una significativa perdita di peso corporeo e una diminuzione del peso dell'intestino tenue nella fase di recupero, rispetto a quella osservata nei topi selvatici di tipo 5-FU. Inoltre, i topi transgenici non riescono a mostrare iperproliferazione compensativa in quanto le cripte sono significativamente più corte che nei topi di tipo selvatico e nei controlli sani. Durante il tentativo di questa procedura, assicurarsi di svuotare completamente l'intestino tenue e di rimuovere l'eccesso di soluzione salina prima di pesare il tessuto solo per ottenere il piccolo peso intestinale.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre, raccogliere e determinare endpoint importanti di piccole lesioni intestinali. E per ottenere efficacemente dati riproducibili. Non dimenticare che lavorare con composti chimici come 5FU e BrdU può essere pericoloso e che le precauzioni, come l'uso di un camice da laboratorio, guanti e una cappa aspirante devono sempre essere prese quando si eseguono queste procedure.
