Usando este protocolo, podemos producir fácilmente un buen número de flavonols de flavanones en una olla. Esta técnica ahorra mano de obra y tiempo, es altamente rentable y fácil de controlar, por lo que tiene un enorme potencial de industrialización. Sí, este método puede proporcionar información sobre la producción económica de otros metabolitos secundarios, pero necesita algunas modificaciones cuando se aplica a él.
Por lo general, no obtendrá nada o muy bajo rendimiento. Mi consejo es manejar enzimas recombinantes en hielo y añadir 10%glicerina a la solución de stock de enzimas. Esto se debe a que sólo a través de la demostración visual una nueva mano puede comprender los detalles importantes y la verdad que afectan a la ejecución exitosa del experimento.
Primero prepare los buffers. Hacer dos veces tampón sintético disolviendo la cantidad adecuada de base TRIS, ascorbato de sodio, ácido alfa cetoglutárico en agua desiminada, y pipeta cantidad adecuada de glicerol a la solución. Utilice una pipeta para añadir ácido clorhídrico para ajustar el pH a 7.2, y ajuste el volumen añadiendo agua desionizada.
Almacene el búfer sintético dos veces a cuatro grados centígrados para su uso futuro. A continuación, haga una solución de 100 veces el stock disolviendo sulfato ferroso heptahidrato en agua desionizada. Haga una solución de 25 flavonoide milimolar disolviendo el flavonoide en metanol, y almacene la solución a menos 20 grados centígrados.
El paso más crítico es configurar un sistema sintético. Para configurar un sistema sintético para producir un flavanol a partir de una flavanona, primero prepare el sistema sintético en un tubo de dos mililitros de acuerdo con los reactivos enumerados en esta tabla. Coloque el tubo abierto en un bloque de calor de agitación a 40 grados centígrados, a 600 rpm durante cuarenta minutos.
Después de eso, terminar la reacción mediante la adición de 10 microlitros de ácido acético, y 100 microlitros de acetato de etilo. Dos horas más tarde, utilice una pipeta para transfiar la fase orgánica superior a un tubo de 1,5 mililitros, y coloque el tubo en una capucha para secar al aire a temperatura ambiente. Para realizar el análisis TLC, primero recupere los tubos de la campana, y vuelva a rediscer el polvo flavanoid en 160 microlitros de metanol en un tubo.
Preparar muestras de flavonoide auténticos con concentraciones en serie, diluyendo la solución de material flavonoide de 25 milimolares en metanol. Cargue un microlitro de la muestra de reacción redisuelta y un microlitro de la muestra de flavonoide auténtico en una placa de poliamida. Haga lo mismo para las otras concentraciones de flavonoide auténtico en la misma placa.
A continuación, en una campana de humo, coloque la placa cargada de muestra en un cilindro de cromatografía lleno de un sistema de disolvente. Fije la placa a la parte inferior del cilindro y ejecute la placa en el sistema de disolvente durante 20 minutos. Seque al aire las placas a temperatura ambiente.
Con una botella de pulverizador, rocíe las placas con una solución etanólica al 1%de cloruro de aluminio, seguida de un secado al aire de nuevo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Visualice los puntos en las placas bajo una luz UV a 254 nanómetros, y tome imágenes, luego en el ordenador, abra el software ImageJ. Haga clic en archivo, abrir, para abrir la imagen que se va a analizar.
Haga clic en la herramienta de selección más rectangular izquierda en la interfaz de usuario de ImageJ. Delinee el ROI de la imagen con el ratón y pulse uno para etiquetar el primer ROI. Mueva la selección rectangular con el ratón a la derecha al siguiente ROI y presione dos para etiquetar el segundo ROI.
Repita para etiquetar todos los demás ROI presionando dos. Pulse tres para generar trazados de perfil para todos los ROI, en una ventana emergente. A continuación, utilice la herramienta de selección de línea recta para soltar líneas base con el fin de definir un área cerrada para cada pico de interés.
Active la herramienta de varita, haciendo clic en el icono correspondiente en la interfaz de usuario de ImageJ. Haga clic dentro del pico para mostrar los resultados de todos los picos en una ventana emergente. A continuación, en Excel, trace los valores grises de la ventana emergente contra las concentraciones de flavonoide correspondientes, para crear una curva estándar basada en TLC del flavonoide auténtico.
A continuación, calcule el rendimiento del flavonoide de interés producido en este protocolo, de acuerdo con la fórmula resultante. Utilice una jeringa para procesar cada muestra secuencialmente a través de filtros de 0,45 micrómetros y 0,22 micrómetros. Cargue las muestras en un sistema HPLC-MS a través de la boquilla de succión y separe las muestras a 30 grados celsius utilizando una columna C18.
Eluda la columna a un mililitro por minuto por un gradiente de 10 a 85 volumen por ciento de acetil nitrilo en agua, y monitorear la absorbancia del eluido de 200 a 800 nanómetros. Realice el análisis LC-MS en un modo iónico negativo, con un flujo de nitrógeno de secado de 10 litros por minuto a 300 grados Celsius, en un flujo de gas de vaina de siete litros por minuto a 250 grados celsius, y recopile datos utilizando un software incorporado. Para extraer cromatógrafos de longitud de onda única, abra el programa de análisis cualitativo y haga clic en file, abra datafile.
Seleccione el archivo que desea analizar en la ventana del archivo de datos abierto y haga clic en Abrir para abrir el archivo. Haga clic con el botón derecho del ratón en la ventana de resultados del cromatograma y, a continuación, extraiga cromatogramas en un menú emergente. En la lista de tipos, haga clic en otros cromatogramas.
En el cuadro combinado del detector, seleccione DAD1 y, a continuación, haga clic en Aceptar para mostrar los resultados de HPLC en la ventana de resultados del cromatograma. Haga clic en el icono de integración manual acoplado en la parte superior de la ventana de resultados del cromatograma. Dibuje la línea base para el pico necesario para el análisis de integración manual con el ratón.
Haga clic en vista, lista de picos de integración, para mostrar los resultados. Copie los resultados de las áreas de pico en Excel y trace una curva estándar basada en HPLC del flavonoide auténtico contra las concentraciones de flavonoide correspondientes y, a continuación, calcule el rendimiento del flavonoide de interés producido en este protocolo de acuerdo con la fórmula resultante. A continuación, repita los mismos procedimientos para extraer cromatogramas de longitud de onda única para analizar los datos de la MS para la masa exacta de compuestos flavonoideos.
Haga clic en el icono de selección de rango en la barra de herramientas de resultados del cromatograma. Seleccione el pico de interés. Haga clic con el botón derecho del ratón en el rango seleccionado y haga clic en el espectro de MS de extracción en el menú emergente para mostrar los resultados en la ventana de resultados del espectro de MS.
Para determinar si este sistema in vitro se puede utilizar para la conversión de una flavanona en un flavonol, NRN se añadió en el sistema. Hubo dos nuevas manchas surgidas en una placa TLC de poliamida. Un punto mostró una distancia de migración similar a la de DHK, y los otros similares a la de KMF.
Un análisis posterior de HPLC y LC-MS demostró que el nuevo producto químico mostraba un tiempo de retención de 12 minutos y 20 minutos respectivamente, en un pico de iones cuasi moleculares M sobre Z a 287 y 285 que eran idénticos a los de DHK y KMF. Para determinar si el sistema se puede utilizar para la conversión de otros flavanones en sus flavonoles correspondientes, SE añadió ERD en el sistema. Dos nuevos puntos en una placa TLC de poliamida mostraron una distancia de migración similar a la de DHQ y QRC respectivamente.
Los análisis de HPLC y LC-MS demostraron que estos nuevos productos químicos revelaron un tiempo de retención de 10 minutos y 16 minutos respectivamente, y un pico de iones cuasi moleculares M sobre Z en 303 y 301, que correspondía exactamente a los de DHQ y QRC. Al preparar el sistema sintético, debe agregar la enzima por último, y añadir el sulfato ferroso insuperable. Sí, proporciona una guía para la producción económica de otros metabolitos secundarios.
