Usando este método podemos examinar directamente la formación de tubos cardíacos, bucles, y la formación de cámara completa sin más manipulaciones experimentales del embrión de ratón. Aunque, utilizamos ratones MLC-2v-tdTomato como ejemplo, este método simple se puede utilizar ampliamente con otras líneas fluorescentes de ratón reportero. La principal ventaja de este protocolo es que es muy simple y no requiere ninguna técnica o equipo complejo.
Se puede realizar en entornos de laboratorio regulares. Después de aparear a las hembras con ratones machos, ambos MLC-2v-tdTomato 8 a 10 semanas de edad, revise las presas en busca de tapones vaginales cada mañana. Colocar las presas embarazadas, eutanizadas en diferentes días después del coitum, en posición supina y rociar el abdomen con 70%etanol.
Utilice tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps para abrir la cavidad abdominal mediante la incisión de la piel y la pared abdominal. Después de localizar cuernos uterinos bilaterales en la parte dorsal de la cavidad abdominal, separe todo el útero usando tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps para cortar cuidadosamente por encima de los oviductos en ambos lados. Coloque todo el útero diseccionado en una placa petri de 10 centímetros con PBS helado.
Usando tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps, separe cuidadosamente cada saco amniótico a lo largo del cuerno uterino. Utilice pinzas para transferir cada embrión a una placa de cultivo de 35 milímetros llena de PBS helado. Usando tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps, abra un saco amniótico y exponga cada embrión cortando el cordón umbilical y luego recorte los tejidos embrionarios adicionales tanto como sea posible sin dañar los embriones.
Bajo un microscopio de disección con un iluminador de microscopio de fibra óptica, corte la cabeza del embrión y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros con 100 microlitros de tampón A para que su genotipado posterior se correlacione con los resultados de la imagen epifluorescente. Usando fórceps finos, abre el pecho del embrión. Con tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps, retire el corazón lejos de los pulmones y la vasculatura.
Utilice pinzas para transferir el corazón embrionario diseccionado a una placa de cultivo de 35 milímetros con PBS. Coloque la placa con corazones embrionarios de ratón bajo un microscopio de disección epifluorescente. Utilice fórceps finos para colocar los corazones embrionarios de manera que los ventrículos en desarrollo estén frente al examinador.
Ajuste el enfoque utilizando un objetivo de 0,63x en modo de campo brillante. Tome exposiciones de campo brillante y capture varias imágenes. Para visualizar la expresión tdTomato, apague un iluminador de microscopio de fibra óptica y configure el filtro para la fluorescencia roja.
Reajuste el enfoque de la imagen si es necesario, ajuste el brillo y el contraste, tome exposiciones rojo-fluorescentes y capture varias imágenes. Para el genotipado de embriones, hierva muestras de cabeza previamente aisladas en el tampón A a 100 grados centígrados durante 30 minutos. Centrifugadora durante dos minutos a 11, 360 veces G.Transfer 20 microlitros de sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 mililitros con 20 microlitros de tampón B y mezclar.
Utilice 4,5 microlitros del sobrenadante mixto como plantilla de ADN y combínelo con 0,5 microlitros de cada uno de los 10 primeros específicos de micromolar, 10 microlitros de polimerasa premezclada 2x y tamp buffer de reacción y luego agregue agua a un volumen total de 20 microlitros. Ejecute un PCR como se describe en el manuscrito. Cargue la reacción completa en la escalera de ADN de 100 pares de bases en un gel de 1% de agarosa y corra a 140 voltios en 1x tampón TAE durante 25 minutos.
Coloque el gel completo en un transilluminador UV y encienda la luz UV para identificar las bandas de ADN. MLC-2v se considera el marcador más temprano para la especificación de la cámara ventricular durante el desarrollo del corazón. En ratones con impactos de reportero de MLC-2v-tdTomato, la expresión relativamente débil de tdTomato en el tubo cardíaco lineal en E8.0 se hace más fuerte en E8.5 como se muestra utilizando imágenes epiflourescentes de montaje integral de los embriones.
Mediante el uso de imágenes epiflourescentes de montaje completo del corazón diseccionado, la formación de la cámara ventricular durante el desarrollo del corazón del ratón se puede determinar fácilmente. En el corazón diseccionado de un embrión de ratón entero en E10.5, la expresión del reportero MLC-2v-tdTomato se mostró en la porción ventricular del corazón y no en el tracto de entrada, el tracto de salida o las aurículas futuras. En E12.5 a E13.5, el reportero de tdTomato se expresa exclusivamente en los ventrículos del corazón de cuatro cámaras.
El patrón de expresión específico del ventricular similar se mostró en el embrión de ratón diseccionado en E16.5. Después de imágenes enteras, el genotipo de los embriones se determinó utilizando dos conjuntos de imprimadores para el genotipado de PCR, confirmando embriones homocigotos que llevaban el alelo knock-in tdTomato, heterocigoto y los embriones de tipo salvaje. Este método es bastante sencillo y fácil de realizar.
El paso crítico es diseccionar corazones embrionarios. Comprender la anatomía cardíaca durante el desarrollo cardíaco es necesario aislar con éxito el corazón de todo el embrión.
