Usando este método, podemos exame direto da formação de tubos cardíacos, looping e formação completa de câmara sem mais manipulações experimentais do embrião do rato. Embora, usemos ratos MLC-2v-tdTomato como exemplo, este método simples pode ser amplamente utilizado com outras linhas de mouse de repórter fluorescentes. A principal vantagem deste protocolo é que ele é muito simples e não requer técnicas ou equipamentos complexos.
Pode ser realizado em ambiente de laboratório regular. Depois de acasalar fêmea com camundongos machos, ambos MLC-2v-tdTomato de 8 a 10 semanas de idade, verifique as barragens para obter plugues vaginais todas as manhãs. Coloque as barragens grávidas, eutanásia em dias diferentes pós coitum, em posição supina e pulverizar o abdômen com 70% de etanol.
Use tesoura cirúrgica afiada e fórceps para abrir a cavidade abdominal por incisão da pele e da parede abdominal. Depois de localizar chifres uterinos bilaterais na parte dorsal da cavidade abdominal, separe todo o útero usando tesoura cirúrgica afiada e fórceps para cortar cuidadosamente acima dos ovidutos de ambos os lados. Coloque todo o útero dissecado em uma placa de petri de 10 centímetros com PBS gelado.
Usando tesoura cirúrgica afiada e fórceps, separe cuidadosamente cada saco amniótico ao longo do chifre uterino. Use pinças para transferir cada embrião para uma placa de cultura de 35 milímetros cheia de PBS gelado. Usando tesouras cirúrgicas afiadas e fórceps, abra um saco amniótico e exponha cada embrião cortando o cordão umbilical e, em seguida, corte tecidos embrionários extras tanto quanto possível sem danificar os embriões.
Sob um microscópio dissecando com um iluminador de microscópio de fibra óptica, corte a cabeça do embrião e transfira-a para um tubo de 1,5 mililitro com 100 microlitros de tampão A para genotipagem posterior para se correlacionar com os resultados de imagens epifluorescentes. Usando fórceps finos, abra o peito do embrião. Com tesoura cirúrgica afiada e fórceps, remova o coração dos pulmões e vasculatura.
Use pinças para transferir o coração embrionário dissecado para uma placa de cultura de 35 milímetros com PBS. Coloque a placa com corações embrionários de rato sob um microscópio de dissecação epifluorescente. Use fórceps finos para posicionar os corações embrionários de tal forma que os ventrículos em desenvolvimento estejam voltados para o examinador.
Ajuste o foco usando um objetivo de 0,63x no modo de campo brilhante. Faça exposições de campo brilhante e capture várias imagens. Para visualizar a expressão tdTomato, desligue um iluminador de microscópio de fibra óptica e defina o filtro para fluorescência vermelha.
Reajustar o foco da imagem, se necessário, ajustar o brilho e o contraste, fazer exposições vermelho-fluorescentes e capturar múltiplas imagens. Para genotipagem de embriões, ferva amostras de cabeça previamente isoladas no buffer A a 100 graus Celsius por 30 minutos. Centrífuga por dois minutos a 11, 360 vezes G.Transfira 20 microliters de supernascer em um novo tubo de 1,5 mililitro com 20 microliters de tampão B e misture.
Use 4,5 microlitros do supernanato misto como modelo de DNA e combine-o com 0,5 microlitros de cada um dos 10 primers avançados e invertidos específicos de micromolar, 10 microlitros de polimerase 2x-premixed e tampão de reação e, em seguida, adicionar água a um volume total de 20 microlitros. Execute um PCR como descrito no manuscrito. Carregue a reação completa em 100 escada de DNA do par base em um gel de 1% de agarose e execute a 140 volts em 1x tampão TAE por 25 minutos.
Coloque o gel completo em um transilluminador UV e ligue a luz UV para identificar as bandas de DNA. MLC-2v é considerado o marcador mais antigo para especificação de câmara ventricular durante o desenvolvimento cardíaco. Em camundongos repórter mlc-2v-tdTomato, a expressão relativamente fraca de tdTomato no tubo cardíaco linear em E8.0 torna-se mais forte em E8.5, como mostrado usando imagens epiflourescentes de montagem total dos embriões.
Usando imagens epiflourescentes de montagem total do coração dissecado, a formação da câmara ventricular durante o desenvolvimento do coração do rato pode ser facilmente determinada. No coração dissecado de um embrião de rato inteiro em E10.5, a expressão repórter MLC-2v-tdTomato foi mostrada na parte ventricular do coração e não no trato de entrada, no trato de saída ou no futuro atria. No E12.5 para o E13.5, o repórter tdTomato é expresso exclusivamente nos ventrículos do coração de quatro câmaras.
O padrão de expressão ventricular semelhante foi mostrado no embrião do rato dissecado em E16.5. Após toda a imagem, o genótipo dos embriões foi determinado usando dois conjuntos de primers para genotipagem PCR, confirmando embriões homozigos carregando o alelo tdTomato, heterozigosos e os embriões do tipo selvagem. Este método é bastante simples e simples de executar.
O passo crítico é dissecar corações embrionários. Entender a anatomia cardíaca durante o desenvolvimento cardíaco é necessário para isolar com sucesso o coração de todo o embrião.
