Utilizzando questo metodo possiamo esamiare direttamente la formazione del tubo cardiaco, il looping e la formazione completa della camera senza ulteriori manipolazioni sperimentali dell'embrione del topo. Anche se, usiamo topi MLC-2v-tdTomato come esempio, questo semplice metodo può essere ampiamente utilizzato con altre linee di mouse reporter fluorescenti. Il vantaggio principale di questo protocollo è che è molto semplice e non richiede tecniche o attrezzature complesse.
Può essere eseguito in normali impostazioni di laboratorio. Dopo aver accoppiato la femmina con topi maschi, entrambi MLC-2v-tdTomato di età da 8 a 10 settimane, controllare le dighe per le spine vaginali ogni mattina. Posare le dighe gravide, eutanasiate in giorni diversi dopo il coitum, in posizione supina e spruzzare l'addome con il 70% di etanolo.
Utilizzare forbici chirurgiche affilate e forcep per aprire la cavità addominale per incisione sia della pelle che della parete addominale. Dopo aver individuato le corna uterine bilaterali nella parte dorsale della cavità addominale, separare l'intero utero usando forbici chirurgiche affilate e forcette per tagliare con cura sopra gli ovidotti su entrambi i lati. Posizionare l'intero utero sezionato in una piastra di petri di 10 centimetri con PBS ghiacciato.
Utilizzando forbici chirurgiche affilate e pini, separare accuratamente ogni sacco amniotico lungo il corno uterino. Utilizzare una pinzetta per trasferire ogni embrione in una piastra di coltura di 35 millimetri piena di PBS ghiacciato. Utilizzando forbici chirurgiche affilate e pini, aprire un sacco amniotico ed esporre ogni embrione tagliando il cordone ombelicale e quindi tagliare il più possibile i tessuti embrionali extra senza danneggiare gli embrioni.
Al microscopio sezionato con un illuminatore a microscopio in fibra ottica, tagliare la testa dell'embrione e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitri con 100 microlitri di tampone A per la successiva genotipizzazione per correlare con i risultati dell'imaging epifluorescente. Usando le forcep fini, aprire il torace dell'embrione. Con forbici chirurgiche affilate e forcep, rimuovere il cuore dai polmoni e dalla vascucolatura.
Utilizzare una pinzetta per trasferire il cuore embrionale sezionato in una piastra di coltura di 35 millimetri con PBS. Posizionare la piastra con cuori embrionali di topo al microscopio a dissezione epifluorescente. Usa le forcep fini per posizionare i cuori embrionali in modo che i ventricoli in via di sviluppo siano rivolti verso l'esaminatore.
Regola lo stato attivo usando un obiettivo 0,63x in modalità campo luminoso. Scatta esposizioni a campo luminoso e cattura più immagini. Per visualizzare l'espressione tdTomato, spegnere un illuminatore per microscopio in fibra ottica e impostare il filtro per la fluorescenza rossa.
Riregolare la messa a fuoco dell'immagine, se necessario, regolare la luminosità e il contrasto, assumere esposizioni rosso-fluorescenti e acquisire più immagini. Per la genotipizzazione dell'embrione, far bollire campioni di testa precedentemente isolati nel tampone A a 100 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare per due minuti a 11, 360 volte G.Trasferire 20 microlitri di supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri con 20 microlitri di tampone B e miscelare.
Utilizzare 4,5 microlitri del supernatante misto come modello di DNA e combinarlo con 0,5 microlitri di ciascuno dei primir in avanti e invertiti specifici per 10 micromolari, 10 microlitri di polimerasi premiscelata 2x e tampone di reazione e quindi aggiungere acqua a un volume totale di 20 microlitri. Eseguire una PCR come descritto nel manoscritto. Caricare la reazione completata in una scala del DNA a coppia di base 100 su un gel di agarosio dell'1% e correre a 140 volt in tampone 1x TAE per 25 minuti.
Posizionare il gel completato su un transilluminatore UV e accendere la luce UV per identificare le bande di DNA. MLC-2v è considerato il primo marcatore per le specifiche della camera ventricolare durante lo sviluppo cardiaco. Nei topi knock-in reporter MLC-2v-tdTomato, l'espressione relativamente debole di tdTomato nel tubo cardiaco lineare a E8.0 diventa più forte a E8.5 come mostrato utilizzando l'imaging epiflourescente a montaggio intero degli embrioni.
Utilizzando l'imaging epiflourescente a montaggio intero del cuore sezionato, la formazione della camera ventricolare durante lo sviluppo del cuore del topo può essere facilmente determinata. Nel cuore sezionato da un intero embrione di topo a E10.5, l'espressione del reporter MLC-2v-tdTomato è stata mostrata nella porzione ventricolare del cuore e non nel tratto di afflusso, nel tratto di deflusso o negli atri futuri. Da E12.5 a E13.5, tdTomato reporter si esprime esclusivamente nei ventricoli del cuore a quattro camere.
Lo schema di espressione specifico ventricolare simile è stato mostrato nell'embrione di topo sezionato all'E16.5. Dopo l'imaging intero, il genotipo degli embrioni è stato determinato utilizzando due serie di primer per il genotipizzazione PCR, confermando gli embrioni omozigoti che trasportano l'allele knock-in tdTomato, l'eterozigote e gli embrioni di tipo selvatico. Questo metodo è piuttosto semplice e semplice da eseguire.
Il passo critico è sezionare i cuori embrionali. Comprendere l'anatomia cardiaca durante lo sviluppo cardiaco è necessario per isolare con successo il cuore dall'intero embrione.
