Aunque la escala es uno de los atributos universales y fundamentales de los sistemas de desarrollo, los mecanismos subyacentes no se han entendido en muchos órganos y tejidos. La técnica de reducción de tamaño del pez cebra presentada en este vídeo hará avanzar su comprensión de los mecanismos subyacentes a los procesos de escalado dinámico. Las ventajas de trabajar con peces cebra son que es fácil realizar imágenes en vivo, genética y análisis cuantitativo.
Nuestra técnica también es muy simple y fácil de aplicar sin ningún equipo especializado o entrenamiento intensivo. La salud de los embriones es la clave para el éxito con esta técnica. Utilice peces jóvenes como padres y tenga cuidado de minimizar el daño mediante la eliminación de las coros.
Y también jugar en el tamaño de la herida en la yema, y cuántas células se eliminan. Como los embriones que utilizamos son muy jóvenes y frágiles, deben manipularse con mucho cuidado al transferir y cortar. Al mismo tiempo, debe ser rápido para que el procedimiento se pueda realizar en el período de tiempo adecuado para el desarrollo.
La demostración visual puede dar una buena idea de cómo producir embriones más pequeños de manera efectiva. Para hacer un lazo de alambre para el corte de embriones, alimentar 20 centímetros de largo de alambre de acero inoxidable rígido y no corrosivo a través de un capilar de vidrio, haciendo un pequeño bucle de un milímetro de largo en la parte superior. Coloque una pequeña gota de esmalte de uñas transparente en la punta del capilar de la clase, entre el capilar y el lazo de alambre para mantenerlo en su lugar, asegurándose de no obtener ningún esmalte de uñas en la porción del lazo, ya que puede dañar los embriones.
Y luego déjalo secar. Utilice cinta de laboratorio para fijar el capilar de vidrio con el lazo en un palillo de madera, dejando alrededor de dos centímetros y medio del capilar de vidrio que se extiende más allá del palillo para que la parte del palillo de la herramienta no se sumerja en el agua más tarde. En un plato Petri de vidrio de 100 milímetros con una espátula de plástico, esparce aproximadamente 0,5 mililitros de 2% de celulosa de metilo cerca del centro de la parte inferior de forma fina y uniforme hasta un grosor de aproximadamente 0,5 milímetros.
Vierta aproximadamente 30 mililitros de una tercera solución de Ringer al lado del plato, y permita que se extienda sobre el resto del plato y cubra la celulosa metilo. Coloque embriones previamente des-coreionados en la etapa de 256 células a una etapa de la célula K en 2%celulosa de metilo, asegurándose de que los embriones estén orientados a su lado. Para cortar la blastula, utilice el lazo de alambre para cortar cerca del poste del animal, perpendicular al eje vegetal animal y cortar aproximadamente 30 a 40% de las células de blastodermo.
Luego toque suavemente los extremos juntos para ayudar a que las células restantes se peguen hacia atrás. Para la yema, utilice el alambre montado para hacer una pequeña herida cerca del poste vegetal mediante la mordedura de la membrana del huevo, lo que hará que la yema se restete durante unos minutos, y luego sane. Cuando la yema deje de rezumar, usa una pipeta para mover el embrión fuera de la celulosa metilo en el mismo plato para su recuperación.
Repita la blastula y el corte de yema para todos los embriones, y luego deje el plato sin perturbar durante 30 minutos mientras los embriones se recuperan. A continuación, utilice una pipeta de vidrio para transferir los embriones al plato de vidrio de 35 milímetros previamente preparado que contiene la solución fresca de un tercio de Ringer y colóquelos en una incubadora de 28,5 grados Celsius para permitir una recuperación completa antes de continuar con la toma de imágenes. Después de realizar un corte de dos pasos con blastula y yema, los embriones mostraron una morfología general aparentemente normal a lo largo de las etapas del desarrollo en comparación con los embriones de control, aparte de la diferencia de tamaño.
Por otro lado, los embriones picados sólo por blastula mostraron una morfología peculiar, especialmente en etapas anteriores. Durante la epiboly, los embriones tenían una apariencia constreñida e indentada. En la siguiente etapa de somita, se encontró que las estructuras de línea media se aplanaban a muchos niveles axiales.
En etapas posteriores, las estructuras del cuerpo adyacentes a la yema, como el cerebro medio y el trasero todavía mostraban una forma relativamente aplanada, posiblemente debido al aumento de la tensión de la yema relativamente más grande. Las imágenes de lapso de tiempo de la formación de somita mostraron que tanto en embriones de control como picados, los tamaños de somitas que se formaron en etapas posteriores eran más pequeños en comparación con los de etapas anteriores. Además, a lo largo de las etapas de formación de somitas, los embriones picados tenían somitas más pequeñas que las de los embriones de control.
Cuando se realizó la técnica de corte de dos pasos en embriones inyectados con mCherry de membrana, la toma de imágenes de sus médulas espinales a las 20 horas después de la fertilización mostró una reducción en las alturas del tubo neural debido a la reducción del tamaño. El corte de dos pasos es muy importante para obtener embriones más pequeños pero normales con alta eficiencia. Es importante recordar no cortar la yema mientras corta las células de la blastula.
Para la yema, haz una pequeña herida en ella para que el contenido se restete. Y la membrana de la yema sanará naturalmente en el tampón adecuado. Debido a que los embriones picados se pueden recuperar rápidamente, cualquier método o análisis se puede aplicar a embriones normales se puede realizar siguiendo el método de reducción de tamaño.
La simplicidad y versatilidad de esta técnica es muy potente ya que cualquiera podría introducir esta técnica para estudiar el problema de escalado en cualquier tejido u órgano en el pez cebra. Creemos que con esta técnica los investigadores pueden abordar los problemas de escalado en una variedad de sistemas que han sido intactos antes. Ya hemos hecho descubrimientos importantes en la escala de la somita y el patrón del tubo neural.
