Este protocolo se puede utilizar para generar un modelo de ratón no aleatorio para probar y cuantificar la reactivación del cromosoma Mecp2 vinculado al X inactivo en el cerebro de un ratón vivo. Este modelo se puede modificar fácilmente para estudiar la reactivación de Xi en otros modelos de enfermedades ligadas al X como el síndrome DDX3X. Soy un post doc en el laboratorio de Sanchita Bhatnagar y voy a demostrar el procedimiento con Zeming Zheng.
Comience colocando el ratón anestesiado en una plataforma estereotáctica con los incisivos enganchados en la barra de mordida del limitador de hocico. Apriete la abrazadera de la nariz mientras mantiene la cabeza del ratón en un plano nivelado. Ajuste la altura de las barras de los oídos para llegar a la parte caudal del canal auditivo para mantener la cabeza inmovilizada.
A continuación, desinfecte la cabeza con toallitas alternas de un antiséptico tópico y 70%etanol. Cuando el ratón esté listo, usa un bisturí estéril para hacer una incisión horizontal de 0,75 centímetros en el cuero cabelludo medio. Utilice una rebaba de 0,45 milímetros para perforar dos agujeros simétricos por encima de los hemisferios cortical derecho e izquierdo a dos milímetros de la sutura sagital y la sutura lambdoid en el centro aproximado del hueso parietal.
Conecte firmemente una jeringa de 10 microlitros a la plataforma estereotáctica y cargue 10 microlitros de inhibidor químico recién preparado en la jeringa. Avance la aguja en el primer orificio de rebaba mientras mantiene la aguja perpendicular al cráneo. Cuando la aguja atraviesa el cráneo, saque a cero las coordenadas de la pantalla digital estereotáctica y avance la punta de la aguja hasta que alcance una profundidad de 2,5 milímetros.
Retirar la aguja de 0,5 milímetros a una profundidad de dos milímetros e inyectar lentamente todo el volumen de 10 microlitros de la solución durante un período de un minuto. Después de que se haya suministrado todo el inhibidor, deje la aguja en el cerebro durante otro minuto antes de retirar la aguja. Repita la inyección en el segundo orificio de la rebaba utilizando el vehículo sólo como control y cierre la piel sobre la incisión.
A continuación, transfiera el ratón desde el aparato estereotáctico a una almohadilla de calefacción Celsius de 37 grados con monitoreo hasta la recuperación completa. Al final del régimen de dosis, fije el ratón en una almohadilla de disección. Use tijeras y fórceps para hacer una incisión lateral a través del integumento y la pared abdominal justo debajo de la caja torácica.
Separe cuidadosamente el hígado del diafragma y corte a través del diafragma a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. Utilice las tijeras para hacer una incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo e inyecte inmediatamente la cámara cardíaca derecha con aproximadamente 15 mililitros de PBS durante un período de dos minutos. Una perfusión exitosa resultará en un cambio de color hepático de rojo a rosa pálido.
Cuando se haya suministrado todo el PBS, perfunda el corazón con aproximadamente 10 mililitros de 4%paraformaldehído en PBS durante dos minutos. Después de cosechar la cabeza, usa tijeras para hacer una incisión de línea media en el cuero cabelludo para exponer el cráneo. Coloque una punta de las tijeras en el foramen magnum para facilitar la creación de una incisión lateral en el cráneo hacia el ojo.
Haga una incisión similar en el otro lado del cráneo manteniendo el extremo de las tijeras lo más superficial posible y corte la región del cráneo entre los ojos y por encima de la nariz del ratón. Usa fórceps para pelar suavemente los huesos craneales de los hemisferios cerebrales y usa una espátula para elevar el cerebro. Disecciona cuidadosamente las fibras del nervio craneal que fijan el cerebro al cráneo y coloca el cerebro en un plato de plástico.
A continuación, extirpar el cerebelo y bulbos olfativos. Para obtener secciones del tejido cerebral, primero fije el cerebro en un tubo de 15 mililitros lleno de 4%paraformaldehído en PBS a cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, enjuague el tejido cerebral al menos tres veces durante cinco minutos a cuatro grados centígrados en PBS fresco por lavado.
Después del último lavado, retire la parte frontal de cada hemisferio con tijeras y fórceps y coloque las muestras en criomoldeos etiquetados hacia abajo. Sumerja cada tejido en un medio de temperatura de corte óptimo antes de congelar las muestras en nitrógeno líquido en una placa Petri de plástico de 10 milímetros para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Para determinar la reactivación de Xi, sumerja secciones de tejido cerebral de cinco a seis micrómetros en la solución de recuperación de antígenos durante cinco minutos en un bloque de calor de 100 grados Celsius.
Al final de la incubación, lave los portaobjetos con cuatro lavados de cinco minutos a temperatura ambiente con PBS fresco por lavado antes de sumergir los portaobjetos en solución de bloqueo. Después de 20 minutos a temperatura ambiente, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en un tampón de lavado fresco por lavado. Mancha las muestras de tejido con los anticuerpos primarios apropiados a cuatro grados Celsius durante la noche.
Imagine las diapositivas en un microscopio de fluorescencia ajustando el contraste y el brillo para permitir la cuantificación del número de células positivas de la GFP para los hemisferios cerebrales de ratón tratados con fármacos y vehículos. Para demostrar la viabilidad del modelo de ratón de inactivación cromosómica X no aleatorio para estudios inactivos de reactivación del cromosoma X, los genotipos del fibroblasto embrionario de ratón transgénico femenino se confirmaron mediante la genotipado de PCR y la citometría de flujo. Según lo evaluado por pcR, la expresión de la GFP etiquetada proteína de unión a CPG de metileno dos genes o MECP2 se reactivó mediante fármaco, pero no por tratamiento vehiculo.
Los fibroblastos embrionarios no aleatorios del cromosoma X también expresaron la GFP nuclear después del tratamiento farmacológico, pero no el tratamiento del vehículo que demuestra que los inhibidores del factor de inactivación del cromosoma X X reactivan el MECP2 vinculado al cromosoma X inactivado en fibroblastos embrionarios de ratón. El tratamiento farmacológico reactiva el cromosoma X MECP2-GFP en aproximadamente el 30% de las células de los hemisferios cerebrales infundidos con fármacos, mientras que no se detecta ninguna reactivación en los hemisferios infundidos de vehículos. La proteína asociada al microtúbulo dos neuronas positivas también son positivas de la GFP en los hemisferios tratados con fármacos indicativos de la expresión MECP2-GFP del cromosoma X inactivado.
El régimen farmacológico dependerá del objetivo y de la eficacia de los inhibidores de moléculas pequeñas, optimizando así la dosis y el tratamiento in vitro antes de realizar la prueba in vivo. El modelo de ratón no aleatorio se puede utilizar para probar diferentes medicamentos ya sea individualmente o en combinación. De hecho, nosotros y otros hemos identificado varios factores de inactivación cromosómica X farmacológica.
