El ECLIA es un método simple pero eficiente para cuantificar los niveles celulares de MeCP2. El ECLIA es rápido, más sensible y más fácil de manejar en comparación con otros métodos de cuantificación como la mancha occidental y el ELISA. Para preparar la solución de lavado, que es 0.5%Tween 20 en PBS, añadir 500 microlitros de Tween 20 a un litro de PBS y mezclar vigorosamente.
Prepare una solución de bloqueo de 3%Blocker A y PBS y revuelva suavemente. Esterilice la solución de bloqueo por filtración. Para preparar la solución diluyente del ensayo, 1%Blocker A y PBS, agregue cinco mililitros de solución de bloqueo a 10 mililitros de PBS.
A continuación, descongele el anticuerpo anti-MeCP2 del ratón monoclonal sobre el hielo. Mezclar 0,67 microlitros del anticuerpo con cuatro mililitros de PBS, luego vórtice la solución. Para recubrir la solución de la placa de unión de 96 pozos de altura, dispensar cuidadosamente 25 microlitros de solución de recubrimiento en la esquina inferior de cada pozo, utilizando una pipeta multicanal.
Coloque suavemente la placa de 96 pozos en cada lado para asegurarse de que la solución de recubrimiento cubra la parte inferior de cada pozo. Selle la placa con papel adhesivo e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Recupere la placa de 96 pozos del refrigerador y retire la lámina.
Retire la solución de recubrimiento de anticuerpos en los pozos arrojándola en un contenedor de residuos. A continuación, toque la placa en una toalla de papel para quitar cualquier solución restante. A continuación, agregue 125 microlitros de solución de bloqueo a cada pozo.
A continuación, vuelva a sellar la placa con papel adhesivo. Coloque la placa en un agitador de microplacas orbital, fijado a 800 RPM, e incubarlo durante 90 minutos a temperatura ambiente. Descongelar sobre hielo un vial de solución de stock de proteína MeCP2 o Tat-MeCP2, lesates cerebrales de ratón y lesates HDF.
Diluir la solución de proteína en tubos limpios como se describe en la tabla dos del manuscrito. A continuación, diluya las muestras de izado. Para las lesates cerebrales del ratón, utilice de uno a 20 microgramos por cada 25 microlitros de tampón de lelisis.
Para el alate HDF, agregue 0.25 a un microgramo por cada 25 microlitros de tampón de lelisis. Después de que la placa de 96 pozos haya estado incubando durante 90 minutos, retire la solución de bloqueo de los pozos arrojándola en un contenedor de residuos. A continuación, toque la placa en una toalla de papel para quitar cualquier solución restante.
A continuación, lave la placa tres veces con 150 microlitros de solución de lavado, añadiendo la solución de lavado y quitándola inmediatamente. Añadir 25 microlitros de estándares y muestras a los pozos de la placa de 96 pozos. Selle la placa e i incuba durante otras cuatro horas a temperatura ambiente con un agitado constante de 800 RPM.
Descongelar el anticuerpo de detección sin etiquetar, conejo policlonal anti-MeCP2, sobre hielo. Utilizando la solución diluyente del ensayo, diluya el anticuerpo en una proporción de uno a 6.000. Cuando la placa de 96 pozos haya terminado de incubar la coctelera, retire las normas y las muestras moviendo la placa en un contenedor de residuos.
A continuación, toque la placa en una toalla de papel para quitar cualquier solución restante. Lave la placa tres veces con 150 microlitros de solución de lavado añadiendo la solución de lavado y quitándola inmediatamente. Agregue 25 microlitros de solución de anticuerpos de detección sin etiquetar a cada pozo con el pipetter multicanal.
Selle la placa e i incuba durante una hora a temperatura ambiente con agitación constante a 800 RPM. Obtenga el anticuerpo secundario específico del refrigerador y colóquelo un hielo. Diluir el cuerpo secundario en solución diluyente de ensayo y mezclar suavemente.
Para extraer el anticuerpo de detección libre sin etiquetar de la placa de 96 pozos, deslice el dedo hacia el contenedor de residuos y, a continuación, puntee la placa en una toalla de papel. Después de lavar la placa tres veces más descrito, agregue 25 microlitros de anticuerpo secundario a cada pozo con el pipeteador multicanal. Selle la placa e i incuba durante una hora a temperatura ambiente con agitación constante a 800 RPM.
Retire el anticuerpo secundario libre entrando en el contenedor de residuos y tocando la placa sobre una toalla de papel y luego lave la placa tres veces, como se describió anteriormente. A cada pozo de la placa, añada 150 microlitros de 1X Tris base Gold Read Buffer con tensioactivo, que contiene tripropilamina como coreactant para la generación de luz. Para evitar la producción de burbujas de aire, utilice técnicas de pipeteo inverso.
Coloque la placa de 96 pocillos en la plataforma de la microplaca con el sistema de detección de electrochemilinoscencia. Con la cámara CCD integrada, comience inmediatamente a capturar datos. Recuentos de señales de registro que corresponden a unidades de luz relativas y son directamente proporcionales a la intensidad de la luz.
Las curvas estándar MeCP2 se generaron a partir de MeCP2 humano en múltiples mediciones. El ECLIA puede cuantificar con precisión MeCP2 humano recombinante en un rango de un nanogrando por mililitro a 1800 nanogramos por mililitro. Utilizando ECLIA, los niveles de proteína MeCP2 se midieron en los licatos nucleares cerebrales a partir de ratones heterocigotos y hembras de tipo salvaje y de un ratón knockout MeCP2.
ECLIA se llevó a cabo en lysates celulares desde un control saludable y desde la línea celular c. 806delG utilizada como modelo para el síndrome de Rett. No se detectó proteína MeCP2 en las líneas celulares mutadas por ECLIA o por inmunofluorescencia.
ECLIA también se utilizó para investigar la captación de Tat-MeCP2 por la línea celular deficiente de MeCP2 horas extras. La precisión de ECLIA inter e intra ensayo se determinó durante tres días consecutivos. Para la futura terapia de reemplazo de proteínas, el parto con MeCP2 se puede optimizar repetidamente después de la evaluación del nivel de proteína por parte de ECLIA.
