Drosophila sirve como buen sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial. Aquí presentamos un protocolo para medir la actividad de la citrato sintasa en el tejido homogeneizar a partir de moscas adultas. Este protocolo no requiere aislamiento de las mitocondrias.
Es rápido y simple y es adecuado para medir la actividad de la citrato sintasa en larvas, células cultivadas y tejidos de mamíferos. Comience por recoger moscas adultas para cada muestra, asegurándose de recoger al menos muestras triplicadas para cada genotipo. Preparar 500 microlitros de tampón de extracción en frío con HEPES de 20 milimolares, un EDTA mililolar y 0,1% tritón X-100 en un tubo de ensayo de 1,5 mililitros para cada muestra.
Anesthetizar las moscas adultas con dióxido de carbono en una almohadilla de anestesia. Para aislar los tórax, fijarlos con un par de fórceps y aislar los abdomens de la mosca cortando a lo largo del borde del tórax y el abdomen con un par de tijeras. Recoger los tórax mosca para el ensayo de actividad de citrato sintasa.
Transfiera 10 tójees de mosca adulta a 100 microlitros de tampón de extracción de hielo en frío inmediatamente y homogeneicelos con un pestillo sobre hielo. Mantenga las muestras frías homogeneizando durante cinco a 10 segundos sobre hielo, dejándolas reposar sobre hielo durante cinco segundos, luego repitiendo hasta que todos los tejidos estén completamente homogeneizados. Aliquot 10 microlitros de cada muestra homogeneizada en un nuevo tubo para la medición del contenido de proteínas, manteniendo estos tubos en hielo también.
Agregue 400 microlitros de tampón de extracción en frío helado a cada muestra restante para un volumen total de 500 microlitros y pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar. Para cada reacción, agregue un microlitro de lito celular diluido a 150 microlitros de la solución de reacción recién preparada. Mezcle bien pipeteando suavemente, asegurándose de evitar la formación de burbujas, luego utilice un lector de placas para medir la absorbancia a 412 nanómetros cada 10 a 30 segundos durante cuatro minutos a 25 grados centígrados.
Trazar los datos como absorbancia a lo largo del tiempo y, a continuación, calcular la pendiente de la parte lineal de la curva. Por último, divida la tasa de reacción o la pendiente por la concentración de proteína de muestra para normalizar la actividad de la citrato sintasa. Se hipotetizó que el derribo de dRNF34 en el músculo Drosophila aumentaría la actividad de citrato mitocondrial sintasa mientras que la eliminación de dPGC-1 revertiría este aumento.
Se estableció una tasa enzimática lineal inicial para cada ensayo;las pendientes de las líneas de tendencia representan las tasas máximas de reacción que son equivalentes a las actividades máximas de citrato sintasa de los diferentes genotipos. Las actividades máximas de citrato sintasa se calcularon a partir de las curvas cinéticas y se normalizaron por concentración de proteínas. Los resultados demostraron que la actividad sintasa de los tórax de mosca de hecho aumentó con el knockdown dRNF34 específico del músculo y el aumento fue revertido por el knockdown dPGC-1 específico del músculo.
Al homogeneizar la muestra, es importante inclinar el tubo y comprobar el homogeneizado para asegurarse de que no hay coágulos y que los tejidos en el tubo están completamente homogeneizados. Después de la recolección de muestras, todos los tratamientos de muestra deben realizarse sobre hielo. El ensayo de actividad de la citrato sintasa se utiliza para cuantificar la masa mitocondrial intacta.
La cuantificación adecuada de la masa mitocondrial intacta es muy importante para evaluar la función mitocondrial.
