La necesidad insurgente de tratamiento de heridas cutáneas. Para identificar las moléculas diana para tratamientos farmacológicos, se requieren sistemas de prueba in vitro e in vivo. Los sistemas apropiados son el ensayo de arañazo in vitro, y la cámara de plegado de la piel dorsal in vivo.
Ambos son procedimientos directos para monitorear la migración celular y la cicatrización de heridas en la piel, en ausencia y presencia de compuestos farmacológicamente activos. Aunque ambas técnicas son directas, los investigadores deben practicar la aplicación de arañazos. Y la piel dorsal doblar la cámara de implante, y heridas para obtener resultados confiables y reproducibles.
La demostración de los procedimientos será realizada por el Dr. Matthias Laschke, cirujano y profesor del Instituto de Cirugía Clínica y Experimental. Antes de comenzar el procedimiento, utilice un marcador permanente ultra fino para marcar una placa de seis pozos por tipo de celda, con una línea horizontal en la parte inferior de cada pozo para delinear la región de arañazos para cada cultivo. Al lado de la placa de fibra primaria explosiones aisladas de tipo salvaje y beta 3 ratones deficientes, en una placa de seis pozos a una 5 veces 10 a la quinta explosión de fibra por concentración de pozo.
En 2 ml de DMEM complementado con 10%suero bovino fetal. Etiquete las placas con el tipo de celda, el genotipo y la fecha. Y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.
A la mañana siguiente añadir 9 micro litros de cada reactivo de transfección a base de lípidos de interés, a tubos de micro centrífuga individuales que contienen 150 micro litros de medio sérico reducido por tubo. Añadir 1,5 micro litros de SIRNA a un segundo tubo de micro centrífuga por reactivo de transfección que contenga 150 micro litros de medio sérico reducido por tubo. Y mezcle cada solución de siRNA con un solo tubo de solución de reactivo de transfección.
Después de vórtices brevemente colocar las mezclas a 21 grados Celsius durante 5 minutos. Durante la incubación reemplace cuidadosamente el supernate en cada pocó. Con 2,25 ml de medio de cultivo fresco por el lado de los pozos.
Al final de la incubación añadir 250 micro litros de la mezcla de reactivo de transfección de siRNA adecuada, dejar caer sabiamente en cada pocóp medio correspondiente de las células. Y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular durante 72 horas. Cuando las células hayan alcanzado el 100% de confluencia, deseche el sobrenadante de cultivo de cada pozo.
Y utilice una punta de pipeta de 200 micro litros para crear arañazos en la monocapa de células confluentes. Vertical a la línea horizontal marcada en la parte inferior de cada pozo. A continuación, enjuague cuidadosamente cada herido bien 2 veces con 2 ml de PPS por lavado.
Para eliminar cualquier factor liberado de las células dañadas, células sueltas o desechos de la zona rayada. Después del segundo lavado añadir 2 ml de medio de cultivo celular fresco complementado con 1 o 10 por ciento de suero a cada pozo. Y capturar imágenes de las heridas en cada placa en el escenario de un microscopio de luz.
Inmediatamente después de rascarse con un aumento de 10X. A continuación, devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Continuar capturando imágenes en los puntos de tiempo experimentales adecuados durante las próximas 30 horas.
Al final del experimento cuantificar el área libre de células iniciales y el área restante después de 6, 10 y 30 horas de cultivo. Determinar el porcentaje del área de rayado rellenada por las celdas migratorias en relación con el área de rayado inicial. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del final, en el tipo salvaje o beta tres knockout C57 negro seis ratón, afeitar cuidadosamente el dorso.
Y aplica un ung en los ojos del animal. Aplica crema depilatoria para eliminar cualquier cabello restante. Retirar la crema después de 10 minutos.
Para preparar la cámara de titanio, fije una parte del marco de la cámara de titanio simétrico, con los tornillos de conexión con tuercas. Mantener de 400 a 500 micrómetros entre las dos partes simétricas de la cámara. Para evitar la compresión de las vesículas sanguíneas en la piel.
Desinfectar la piel expuesta con 70% de etanol. Y agarra un pliegue de piel delante de una fuente de luz. Coloque la línea media de la doble capa de piel donde se implantará la cámara de titanio.
Y la piel fija y lonja caudalmente con una sutura de polipropileno. Apriete el otro lado de la sutura en un estante metálico para levantar la piel doblada. Y ajuste la altura del bastidor para permitir que el ratón se siente cómodamente.
Suturar el primer marco de la cámara de titanio por suturas de polipropileno en el borde superior a la parte posterior del pliegue de la piel dorsal. Después de reconfirmar la sedación use tijeras finas para hacer pequeñas incisiones en la piel. Y pase los dos tornillos de conexión unidos a la primera mitad de la cámara de titanio a través de la base del pliegue de la piel.
Retire el ratón del bastidor y colóquelo en una posición lateral. Coloque la segunda mitad de cortesía de la cámara de titanio encima de los 3 tornillos de conexión. Y aplicar manualmente una ligera presión para pasar estos tornillos a través de la segunda mitad del marco de titanio.
La capa de piel plegada ahora se intercala entre las dos mitades simétricas del marco de titanio. A continuación, fije ambas piezas simétricas con tuercas de acero inoxidable. Usando un punzón de biopsia estandarizado de 2 ml de diámetro, marque el área de la herida en el centro de la piel, dentro de la ventana de observación de la cámara de plegado de la piel.
Y usa fórceps finos y tijeras para eliminar toda la epidermis y la dermis dentro de la marca. Para crear una herida circular. Limpie la herida cuadrada de 3 y medio a 4 milómetros y medio con 0,5 ml de solución salina esterilizada.
Y cubre la herida con un cubreobjetos de vidrio. Utilice el alicate de anillo de presión en la cámara de titanio para fijar el cubreobjetos en su lugar. Y transfiera inmediatamente el ratón a la etapa de imagen de un estereomicroscopio.
A continuación, imagine la herida con un aumento de 40X. Antes de colocar el ratón en una jaula con monitoreo hasta la recuperación completa. Después de crear un rasguño usando una punta de pipeta de 200 micro litros como se demostró, en este experimento representativo, las células de ambos genotipos migraron al área de arañazos y cerraron la brecha.
A continuación, se cuantificó la migración de celdas como el porcentaje de área de rayado rellenada por la migración de celdas 6 horas después de realizar el scratch. Por ejemplo, en este experimento de migración de cav beta 3 explosiones de fibra deficientes cerró el área de arañazos significativamente antes que las explosiones de fibra de ratones de tipo salvaje. Para confirmar el efecto dependiente de Cav beta 3 observado en las explosiones de fibra deficientes de Cav beta 3, las explosiones de fibra de tipo salvaje se trans infectaron con siRNA para regular la proteína Cav beta 3.
Las explosiones de fibra tratadas con los siRNAS específicos de Cav beta 3 se comportaron como explosiones de fibra deficientes beta 3. Para comparar la cicatrización de heridas cutáneas entre ambos genotipos, el área de la herida en la cámara de plegado de la piel fue fotografiada directamente después de la herida. Y la herida fue se imán en las siguientes 2 semanas.
Los tamaños de las heridas se midieron en las imágenes y el área de la herida, en un día determinado se expresó como, el porcentaje de la zona inicial de la herida. Como era de esperar, la tasa de cierre de la herida se incrementó en ratones con deficiencia de Cav beta 3 en comparación con los controles de tipo salvaje. Asegúrese de aplicar la misma presión a la punta de la pipeta, para cada rasguño y para que coincida con los arañazos con las líneas marcadas en la parte inferior de la placa lo más cerca posible.
La ventana de observación de la cámara de plegado de la piel dorsal se puede abrir en cualquier momento durante el proceso de curación. Permite la aplicación tópica de diferentes compuestos farmacológicamente activos. También es posible extirpar el área de los heridos en diferentes etapas del proceso de curación.
Para análisis bioquímicos o histológicos de proteínas moleculares.
