피부 상처의 치료에 대한 반란의 필요성. 약물 치료에 대 한 대상 분자를 식별 하려면, 시험 관 및 생체 내 테스트 시스템 필요. 적절한 시스템은 생체 외 스크래치 분석, 및 생체 내 등등 피부 접이식 챔버입니다.
둘 다 약리학적활성 화합물의 부재와 존재에서 세포 이동 및 피부 상처 치유를 모니터링하기위한 직선 앞으로 절차입니다. 두 기술이 모두 직선적이지만 조사관은 스크래치 응용 프로그램을 연습해야 합니다. 그리고 등변 피부 접이식 챔버 이식, 그리고 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 상처.
절차의 데모는 박사 마티아스 Laschke에 의해 수행됩니다, 임상 및 실험 수술 연구소의 외과 의사 및 교수. 절차를 시작하기 전에 초미세 영구 마커를 사용하여 셀 유형당 6 개의 우물 플레이트를 표시하고 각 웰의 하단에 수평 선이 되어 각 배양에 대한 스크래치 영역을 묘사합니다. 다음 플레이트 1차 섬유 폭발은 야생형 및 베타 3 결핍 마우스로부터 분리되어, 6개의 웰 플레이트에서 5배 10에서 5배 의 5배 섬유 폭발에 잘 농도당 폭발한다.
DMEM의 2mL에서 10 %의 태아 소 세럼으로 보충. 세포 유형, 유전자형 및 날짜로 플레이트에 레이블을 지정합니다. 그리고 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다.
다음 날 아침, 각 지질 기반 의 형질 전환 시약의 마이크로 리터 9 마이크로 리터를 튜브 당 150 마이크로 리터의 감소 된 혈청 매질을 포함하는 개별 마이크로 원심 분리 튜브에 추가합니다. 튜브 당 150 마이크로 리터의 감소 된 혈청 매체를 포함하는 transfection 시약 당 두 번째 마이크로 원심 분리튜브에 1.5 마이크로 리터의 siRNA를 추가하십시오. 각 siRNA 용액을 단일 형질 시약 용액과 혼합합니다.
잠시 소용돌이 후 혼합물을 섭씨 21도에서 5분간 배치합니다. 인큐베이션 동안 각 우물의 슈퍼네이트를 조심스럽게 교체하십시오. 우물의 측면 아래로 신선한 문화 매체의 2.25mL.
인큐베이션의 끝에서 적절한 siRNA 경질 시약 혼합물의 250 마이크로 리터를 추가하고, 세포의 각 해당 우물에 현명하게 드롭. 그리고 72 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다. 세포가 100%에 도달하면 각 우물에서 배양 상류를 폐기하십시오.
그리고 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 컨클레이트 셀 단층에서 스크래치를 만듭니다. 각 웰의 하단에 표시된 수평 선으로 수직입니다. 그런 다음 조심스럽게 세차 당 PPS의 2mL로 2 번 잘 부상 각 상처를 씻어.
손상된 세포에서 방출된 요인을 제거하려면, 긁힌 부위에서 느슨한 세포 또는 파편. 두 번째 세척 후 신선한 세포 배양 배지의 2mL을 각 우물에 1 또는 10 %의 혈청으로 보충합니다. 그리고 가벼운 현미경의 단계에서 각 접시에 상처의 이미지를 캡처합니다.
10X 배율에서 긁힌 직후. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 다음 30시간 동안 적절한 실험 시간 지점에서 이미지를 계속 캡처합니다.
실험의 끝에서 초기 세포 자유 영역과 6, 10 및 30 시간의 배양 후 남은 영역을 정량화한다. 초기 스크래치 영역을 기준으로 마이그레이션 셀에 의해 다시 채워진 스크래치 영역의 백분율을 결정합니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 야생 유형 또는 베타 3 녹아웃 C57 블랙 6 마우스에서, 신중하게 dorsum을 면도.
그리고 동물의 눈에 연고를 적용합니다. 남은 모발을 제거하기 위해 디필 크림을 바르습니다. 10 분 후에 크림을 제거합니다.
티타늄 챔버를 준비하려면 대칭 티타늄 챔버 프레임의 한 부분을 너트와 연결된 나사로 수정합니다. 챔버의 두 대칭 부분 사이에 400 내지 500 마이크로미터를 유지한다. 피부에 혈액 소포의 압축을 피하기 위해.
노출된 피부를 70%에탄올로 소독합니다. 그리고 광원 앞에서 피부의 주름을 잡습니다. 티타늄 챔버가 이식될 곳에 피부 의 이중 층의 중간 선을 배치합니다.
그리고 두개골과 캐디폴리 프로필렌 봉합사로 피부 주름을 고정합니다. 접힌 피부를 들어 올리기 위해 금속 랙에 봉합사의 반대편을 조입니다. 그리고 마우스가 편안하게 앉을 수 있도록 랙의 높이를 조정합니다.
티타늄 챔버의 첫 번째 프레임을 등쪽 피부 주름의 뒷면에 우수한 가장자리에 폴리 프로필렌 봉합사에 의해 봉합. 세이빙을 재확인한 후 미세 한 가위를 사용하여 피부에 작은 절개를 만듭니다. 그리고 티타늄 챔버의 상반기에 부착 된 두 개의 연결 나사를 피부 주름의 베이스를 통해 전달합니다.
랙에서 마우스를 제거하고 동물을 측면 위치에 놓습니다. 티타늄 챔버의 두 번째 무료 반쪽을 3개의 연결 나사 위에 놓습니다. 그리고 티타늄 프레임의 후반을 통과하기 위해 수동으로 약간의 압력을 가합니다.
접힌 피부 층은 이제 티타늄 프레임의 두 대칭 반쪽 사이에 끼어 있습니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 너트로 대칭 부품을 모두 수정합니다. 표준화된 2mL 직경생검 펀치를 사용하여 피부 접이식 챔버의 관찰 창 내에서 피부 중앙에 있는 상처 부위를 표시합니다.
그리고 미세 한 집게와 가위를 사용하여 마크 내의 전체 표피와 진피를 제거합니다. 원형 상처를 만들수 있습니다. 멸균 식염수 0.5mL로 3반~4반의 밀로미터 제곱 상처를 청소합니다.
그리고 유리 커버 슬립으로 상처를 덮습니다. 티타늄 챔버의 스냅 링 펜치를 사용하여 커버슬립을 제자리에 고정시하십시오. 그리고 마우스를 스테레오 현미경의 이미징 단계로 즉시 전송합니다.
그런 다음 상처를 40배배속도로 이미지화합니다. 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 케이지에 넣기 전에. 입증된 바와 같이 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 스크래치를 만든 후, 이 대표적인 실험에서 두 유전자형의 세포가 스크래치 영역으로 이동하고 간격을 닫았다.
세포 이동은 스크래치를 수행한 후 6시간 동안 세포를 마이그레이션하여 다시 채워진 스크래치 영역의 백분율로 정량화되었다. 예를 들어 Cav beta 3 결핍 섬유 폭발을 마이그레이션하는 이 실험에서 야생 형 마우스의 섬유 폭발보다 훨씬 일찍 스크래치 영역을 폐쇄했습니다. Cav 베타 3 결핍 섬유 폭발에서 관찰된 Cav beta 3 의존효과를 확인하기 위해, 야생형 섬유 폭발은 Cav beta 3 단백질을 조절하기 위해 siRNA에 감염되었다.
Cav 베타 3 특정 siRNAs로 처리된 섬유 폭발은 베타 3 결핍 섬유 폭발처럼 행동합니다. 두 유전자형 사이의 피부 상처 치유를 비교하기 위해, 피부 접이식 챔버의 상처 부위는 상처 후 직접 촬영되었다. 그리고 상처는 다음 2 주 동안 이미지되었다.
상처의 크기는 이미지와 상처 부위에 측정되었으며, 주어진 날에는 초기 상처 부위의 백분율로 표현되었다. 예상대로 카베 베타 3 결핍 마우스에서 상처 폐쇄율이 야생형 대조군과 비교하여 증가하였다. 각 스크래치에 대해 파이펫 팁에 동일한 압력을 가하고 스크래치를 플레이트 바닥의 표시된 선에 가능한 한 가깝게 일치해야 합니다.
등등 피부 접이식 챔버의 관찰 창은 치유 과정에서 언제든지 열 수 있습니다. 다른 약리학적 활성 화합물의 국소 적용을 허용. 또한 치유 과정의 다른 단계에서 부상당한 부위를 소비 할 수 있습니다.
분자 단백질 생화학 적 또는 조직학적 분석을 위해.
