Повстанцы нуждаются в лечении кожных ран. Для определения ваших целевых молекул для лечения наркотиков, в пробирке и in vivo тестовых систем не требуется. Соответствующие системы в пробирке нуля анализ, и in vivo спинной кожи сложить камеру.
Оба являются прямыми процедурами для мониторинга миграции клеток и заживления ран кожи, при отсутствии и наличии фармакологически активных соединений. Хотя оба метода прямо вперед, следователи должны практиковать применение нуля. И спинной кожи сложить камерной имплантации, и раны для получения надежных и воспроизводимых результатов.
Демонстрацию процедур будет делать д-р Маттиас Лашке, хирург и профессор из Института клинической и экспериментальной хирургии. Перед началом процедуры используйте сверхтонкий перманентный маркер, чтобы отметить один шесть хорошо пластины на тип ячейки, с горизонтальной линии в нижней части каждой скважины, чтобы разграничить область нуля для каждой культуры. Следующая пластина первичного волокна взрывов изолированы от дикого типа и бета 3 дефицитных мышей, в шесть пластины хорошо в 5 раз от 10 до пятого волокна взрывов на концентрацию хорошо.
В 2 мл ДМЭМ дополняется 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота. Наклеить таблички с типом ячейки, генотипом и датой. И поместите тарелки в инкубатор клеточной культуры на 24 часа.
На следующее утро добавить 9 микролитров каждого липидного реагента трансфекции на основе интереса, к отдельным микро центрифуг трубки, содержащие 150 микролитров уменьшенной среды сыворотки на трубку. Добавьте 1,5 микролитров сирны во вторую микро центрифугу на трансфектный реагент, содержащий 150 микролитров пониженной среды сыворотки на трубку. И смешать каждый раствор siRNA с одной трубкой трансфекции реагентного раствора.
После краткого вихря место смеси на 21 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Во время инкубации тщательно замените супернят в каждой колодец. С 2.25mL свежей культуры среды вниз стороне скважин.
В конце инкубации добавить 250 микролитров соответствующей смеси трансфекции siRNA, падение мудрым в каждом соответствующем хорошо клеток. И верните пластины в инкубатор клеточной культуры на 72 часа. Когда клетки достигли 100% слияния, отбросить культуру supernatant из каждой хорошо.
И использовать 200 микролитровый наконечник пипетки для создания царапин в монослойной ячейки. Вертикаль к отмеченной горизонтальной линии в нижней части каждой скважины. Затем тщательно промыть каждый раненый хорошо 2 раза с 2mL PPS за стирку.
Чтобы удалить любые освобожденные факторы из поврежденных клеток, свободных клеток или мусора из поцарапаемой области. После второй стирки добавить 2 мл свежей клеточной культуры среды дополняется 1 или 10 процентов сыворотки для каждого хорошо. И захватить изображения ран в каждой пластине на сцене светового микроскопа.
Сразу после царапин при 10X увеличении. Затем верните пластину в инкубатор клеточной культуры. Продолжение захвата изображений в соответствующих экспериментальных точках времени в течение следующих 30 часов.
В конце эксперимента количественная оценка начальной свободной от клеток области и оставшейся площади после 6, 10 и 30 часов культуры. Определить процент от площади царапин, заселенной мигрирующими ячейками по отношению к первоначальной области царапины. После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша, в диком типе или бета три нокаута C57 черный шесть мышей, тщательно брить спину.
И нанесите мазь на глаза животного. Нанесите крем для депиля applyatory для того чтобы исключить все остальные волосы. Удаление крема через 10 минут.
Чтобы подготовить титановую камеру, зафиксните одну часть симметричной титановой камерной рамы, со соединительными винтами с гайками. Для поддержания от 400 до 500 микрометров между двумя симметричными частями камеры. Чтобы избежать сжатия пузырьков крови в коже.
Дезинфицировать обитуемую кожу 70%этанолом. И схватить складку кожи перед источником света. Распоитите среднюю линию двойного слоя кожи туда, где будет имплантирована титановая камера.
И черепно и caudally исправить складку кожи с полипропиленовым швом. Затяните другую сторону шва на металлическую стойку, чтобы поднять сложенную кожу. И отрегулируйте высоту стойки, чтобы мышь сидеть удобно.
Шов первый каркас титановой камеры полипропиленовыми швами на нем превосходит край спинной кожи. После подтверждения сеяния используйте тонкие ножницы, чтобы сделать небольшие разрезы в коже. И пройти два соединительных винта прилагается к первой половине титановой камеры через основание кожи раза.
Снимите мышь со стойки и поместите животное в боковое положение. Поместите вторую бесплатную половину титановой камеры поверх 3 соединительных винтов. И вручную применить небольшое давление, чтобы пройти эти винты через вторую половину титановой рамы.
Сложенный слой кожи теперь зажат между двумя симметричными половинками титановой рамы. Затем исправить обе симметричные части с орехами из нержавеющей стали. Используя стандартизированный пунш биопсии диаметром 2 мЛ, отметь область раны в центре кожи, в окне наблюдения камеры складки кожи.
И использовать тонкие миппы и ножницы, чтобы удалить весь эпидермис и дерма в знак. Создать круглую рану. Очистите рану в квадрате от 3,5 до 4 с половиной милометров с 0,5 мл стерильного солевого раствора.
И накройте рану стеклянной крышкой. Используйте плоскогубец кольца оснастки на титановой камере, чтобы исправить крышку на месте. И немедленно перенесите мышь на стадию визуализации стереомикроскопа.
Затем изображение раны при увеличении 40X. Перед тем, как поместить мышь в клетку с мониторингом до полного выздоровления. После создания царапины с помощью 200 микролитровый наконечник пипетки, как попродемонстрировано, в этом репрезентативном эксперименте, клетки из обоих генотипов мигрировали в область царапин и закрыли зазор.
Миграция клеток была затем количественно, как процент нуля области заселены мигрирующих клеток 6 часов после выполнения нуля. Например, в этом эксперименте миграция Cav бета 3 недостаточного волокна взрывов закрыты области нуля значительно раньше, чем волокна взрывов от диких мышей типа. Чтобы подтвердить Cav бета 3 зависимый эффект наблюдается в Cav бета 3 недостаточного волокна взрывов, дикого типа волокна взрывов были трансфицированы с siRNA вниз регулировать Cav бета 3 белка.
Волокно взрывов, обработанных Cav бета 3 конкретных siRNAs вели себя как бета 3 недостаточное волокно взрывов. Для сравнения заживления раны кожи между обоими генотипами, область раны в камере складки кожи была сфотографирована сразу после ранения. И рана была изображена в течение следующих 2 недель.
Размеры ран измерялись на снимках и в области раны, в тот или иной день была выражена процентная доля первоначальной области раны. Как и ожидалось, скорость закрытия раны была увеличена в Cav бета 3 дефицитных мышей по сравнению с дикими контроля типа. Не забудьте применить равное давление на кончик пипетки, для каждой царапины и сопоставить царапины с отмеченными линиями на дне пластины как можно ближе.
Окно наблюдения спинной камеры складки кожи может быть открыто в любое время во время процесса заживления. Позволяет актуальное применение различных фармакологически активных соединений. Также можно подакцизиз иметь подакцизную часть на разных стадиях процесса заживления.
Для молекулярно-белкового биохимического или гистологического анализа.
