Le besoin des insurgés pour le traitement des blessures de la peau. Pour identifier vos molécules cibles pour les traitements médicamenteux, des systèmes de test in vitro et in vivo sont nécessaires. Les systèmes appropriés sont l’essai in vitro d’éraflure, et la chambre dorsale in vivo de pli de peau.
Les deux sont des procédures simples pour surveiller la migration cellulaire et la cicatrisation des plaies cutanées, en l’absence et la présence de composés pharmacologiquement actifs. Bien que les deux techniques soient simples, les chercheurs devraient pratiquer l’application de rayures. Et l’implantation dorsale de chambre pliante de peau, et blessante pour obtenir des résultats fiables et reproductibles.
La démonstration des interventions sera effectuée par le Dr Matthias Laschke, chirurgien et professeur à l’Institut de chirurgie clinique et expérimentale. Avant de commencer la procédure, utilisez un marqueur permanent ultra fin pour marquer une plaque de six puits par type de cellule, avec une ligne horizontale au bas de chaque puits pour délimifier la région de rayures pour chaque culture. Les explosions primaires de fibres de plaque suivante isolées de type sauvage et bêta 3 souris déficientes, dans une plaque de six puits à 5 fois 10 à la cinquième fibre souffle par concentration de puits.
Dans 2mL de DMEM complété avec le sérum bovin foetal de 10%. Étiquetez les plaques avec le type de cellule, le génotype et la date. Et placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.
Le lendemain matin, ajoutez 9 micro litres de chaque réaccélément de transfection à base de lipides d’intérêt, à des tubes individuels de micro centrifugeuse contenant 150 micro litres de sérum moyen réduit par tube. Ajouter 1,5 micro litres de siRNA à un deuxième tube de micro centrifugeuse par réaugnant transfection contenant 150 micro litres de sérum moyen réduit par tube. Et mélanger chaque solution siRNA avec un seul tube de solution de réaccente de transfection.
Après avoir brièvement vortexing placer les mélanges à 21 degrés Celsius pendant 5 minutes. Pendant l’incubation, remplacer soigneusement le superné dans chaque puits. Avec 2,25 mL de culture fraîche sur le côté des puits.
À la fin de l’incubation ajouter 250 micro litres du mélange approprié de réaccfection transfection siRNA, laisser tomber sage dans chaque puits correspondant de cellules. Et retourner les plaques à l’incubateur de culture cellulaire pendant 72 heures. Lorsque les cellules ont atteint 100% confluent, jeter la culture supernatant de chaque puits.
Et utilisez une pointe pipette de 200 micro litres pour créer une égratignure dans le monocouche à cellules confluentes. Verticale à la ligne horizontale marquée au bas de chaque puits. Rincez ensuite soigneusement chaque puits blessé 2 fois avec 2mL de PPS par lavage.
Pour éliminer tous les facteurs libérés des cellules endommagées, des cellules lâches ou des débris de la zone rayée. Après le deuxième lavage ajouter 2mL de culture cellulaire fraîche moyenne complétée par 1 ou 10 pour cent sérum à chaque puits. Et capturer des images des blessures dans chaque plaque sur la scène d’un microscope léger.
Immédiatement après le grattage à un grossissement 10X. Retournez ensuite la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Continuer à capturer des images aux points de temps expérimentaux appropriés pour les prochaines 30 heures.
À la fin de l’expérience quantifier la zone initiale libre de cellules et la zone restante après 6, 10 et 30 heures de culture. Déterminer le pourcentage de la zone d’éraflure repeuplée par les cellules migrées par rapport à la zone de éraflure initiale. Après avoir confirmé un manque de réponse à pincement d’orteil, dans le type sauvage ou bêta trois KO C57 noir six souris, raser soigneusement le dorsum.
Et appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal. Appliquer de la crème depilatory pour éliminer les cheveux restants. Retirer la crème après 10 minutes.
Pour préparer la chambre en titane, fixez une partie du cadre symétrique de chambre en titane, avec les vis de raccordement avec des écrous. Maintenir de 400 à 500 micromètres entre les deux parties symétriques de la chambre. Pour éviter la compression des vésicules sanguines dans la peau.
Désinfecter la peau exposée avec 70% d’éthanol. Et saisir un pli de la peau en face d’une source de lumière. Placez la ligne médiane de la double couche de peau à l’endroit où la chambre de titane sera implantée.
Et cranially et caudally fixer le pli de la peau avec une suture en polypropylène. Serrer l’autre côté de la suture sur une grille métallique pour soulever la peau pliée. Et ajustez la hauteur de la grille pour permettre à la souris de s’asseoir confortablement.
Suture le premier cadre de la chambre de titane par sutures de polypropylène sur elle bord supérieur à l’arrière du pli de la peau dorsale. Après la reconfirmation de la sedation utiliser des ciseaux fins pour faire de petites incisions dans la peau. Et passer les deux vis de connexion attachées à la première moitié de la chambre de titane à travers la base du pli de la peau.
Retirez la souris de la grille et placez l’animal dans une position latérale. Placez la deuxième moitié gratuite de la chambre en titane sur les 3 vis de raccordement. Et appliquez manuellement une légère pression pour passer ces vis à travers la seconde moitié du cadre en titane.
La couche de peau pliée est maintenant prise en sandwich entre les deux moitiés symétriques du cadre en titane. Fixez ensuite les deux parties symétriques avec des écrous en acier inoxydable. À l’aide d’un poinçon normalisé de biopsie de 2 mL de diamètre, marquer la zone de la plaie au centre de la peau, dans la fenêtre d’observation de la chambre pliante de la peau.
Et utilisez des forceps fins et des ciseaux pour enlever l’épiderme et le derme entiers dans la marque. Pour créer une plaie circulaire. Nettoyez la plaie carrée de 3 ans et demi à 4 milometer avec 0,5 mL de salin de stérilisation.
Et couvrez la plaie d’un couvre-verre. Utilisez la pince à anneau snap sur la chambre en titane pour fixer le coverslip en place. Et transférez immédiatement la souris au stade d’imagerie d’un stéréomicroscope.
Puis l’image de la plaie à un grossissement 40X. Avant de placer la souris dans une cage avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Après avoir créé une égratignure à l’aide d’une pointe de pipette de 200 micro litres comme démontré, dans cette expérience représentative, les cellules des deux génotypes ont migré dans la zone d’égratignure et fermé l’écart.
La migration cellulaire a ensuite été quantifiée en pourcentage de la zone d’éraflure repeuplée par les cellules migrables 6 heures après l’exécution de l’égratignure. Par exemple, dans cette expérience, la migration des souffles de fibres déficientes Cav beta 3 a fermé la zone d’éraflure beaucoup plus tôt que les explosions de fibres provenant de souris de type sauvage. Pour confirmer l’effet dépendant de la bêta 3 cav observé dans les explosions de fibres déficientes cav beta 3, des explosions de fibres de type sauvage ont été transfectées avec du siRNA pour réguler vers le bas la protéine Cav beta 3.
Les explosions de fibres traitées avec les siARN spécifiques de la bêta cav 3 se sont comportées comme des explosions de fibres déficientes bêta 3. Pour comparer la cicatrisation des plaies cutanées entre les deux génotypes, la zone de la plaie dans la chambre pliante de la peau a été photographiée directement après avoir été blessée. Et la blessure a été photographiée au cours des 2 semaines suivantes.
La taille des blessures a été mesurée sur les images et la zone de la plaie, un jour donné a été exprimée comme, le pourcentage de la zone de la plaie initiale. Comme prévu, le taux de fermeture des plaies a été augmenté chez les souris déficientes Cav beta 3 par rapport aux témoins de type sauvage. Assurez-vous d’appliquer une pression égale sur la pointe pipette, pour chaque égratignure et de faire correspondre les rayures aux lignes marquées sur le fond de la plaque aussi étroitement que possible.
La fenêtre d’observation de la chambre dorsale pliante de la peau peut être ouverte à tout moment pendant le processus de guérison. Permettant l’application topique de différents composés pharmacologiques actifs. Il est également possible d’exciser la zone blessée à différents stades du processus de guérison.
Pour l’analyse biochimique ou histologique des protéines moléculaires.
