A necessidade insurgente de tratamento de feridas de pele. Para identificar suas moléculas-alvo para tratamentos medicamentosos, são necessários sistemas de teste in vitro e in vivo. Os sistemas apropriados são o ensaio de arranhão in vitro, e a câmara de dobra de pele in vivo dorsal.
Ambos são procedimentos diretos para monitorar a migração celular e a cicatrização de feridas na pele, na ausência e presença de compostos farmacologicamente ativos. Embora ambas as técnicas sejam diretas, os investigadores devem praticar a aplicação do arranhão. E a implantação da câmara de dobra dorsal da pele, e ferida para obter resultados confiáveis e reprodutíveis.
A demonstração dos procedimentos será feita pelo Dr. Matthias Laschke, cirurgião e professor do Instituto de Cirurgia Clínica e Experimental. Antes de iniciar o procedimento, use um marcador permanente ultra fino para marcar uma placa de seis poços por tipo de célula, com uma linha horizontal na parte inferior de cada poço para delinear a região de risco para cada cultura. As próximas explosões de fibra primária da placa isoladas do tipo selvagem e camundongos deficientes beta 3, em uma placa de seis poços a uma placa de 5 vezes 10 para a quinta explosão de fibra por concentração de poço.
Em 2mL de DMEM suplementado com soro bovino 10%. Rotule as placas com o tipo de célula, genótipo e data. E coloque as placas na incubadora de cultura celular por 24 horas.
Na manhã seguinte, adicione 9 micro litros de cada reagente de transfecção à base de lipídios de interesse, a tubos individuais de micro centrífugas contendo 150 micro litros de meio soro reduzido por tubo. Adicione 1,5 micro litros de siRNA a um segundo tubo de micro centrífugas por reagente de transfecção contendo 150 micro litros de meio soro reduzido por tubo. E misture cada solução siRNA com um único tubo de solução de reagente transfeccionado.
Depois de brevemente vórtice coloque as misturas a 21 graus Celsius por 5 minutos. Durante a incubação substitua cuidadosamente o supernato em cada poço. Com 2,25mL de cultura fresca meio ao lado dos poços.
No final da incubação adicione 250 micro litros da mistura apropriada de reagente de transfecção siRNA, solte em sábio em cada poço correspondente de células. E devolva as placas à incubadora de cultura celular por 72 horas. Quando as células atingirem 100% de confluência, descarte a cultura sobrenatária de cada poço.
E use uma ponta de pipeta de 200 micro litros para criar um arranhão na monocamada de célula confluente. Vertical para a linha horizontal marcada na parte inferior de cada poço. Em seguida, enxágue cuidadosamente cada ferido bem 2 vezes com 2mL de PPS por lavagem.
Para remover quaisquer fatores liberados das células danificadas, células soltas ou detritos da área arranhada. Após a segunda lavagem adicione 2mL de cultura celular fresca complementada com 1 ou 10% de soro para cada poço. E capturar imagens das feridas em cada placa no palco de um microscópio leve.
Imediatamente após coçar em uma ampliação de 10X. Em seguida, devolva a placa para a incubadora de cultura celular. Continuando a capturar imagens nos pontos de tempo experimentais apropriados para as próximas 30 horas.
Ao final do experimento quantificar a área livre de células iniciais e a área restante após 6, 10 e 30 horas de cultura. Para determinar a porcentagem da área de risco repovoada pelas células migratórias em relação à área inicial de risco. Depois de confirmar a falta de resposta ao toe pinch, no tipo selvagem ou beta três nocaute C57 preto seis mouse, cuidadosamente raspar o dorso.
E aplique pomada aos olhos do animal. Aplique creme depilatório para eliminar qualquer cabelo restante. Removendo o creme após 10 minutos.
Para preparar a câmara de titânio, fixar uma parte da estrutura da câmara de titânio simétrico, com os parafusos de conexão com porcas. Para manter de 400 a 500 micrômetros entre as duas partes simétricas da câmara. Para evitar a compressão das vesículas sanguíneas na pele.
Desinfete a pele exposta com 70% de etanol. E segure uma dobra de pele na frente de uma fonte de luz. Posicione a linha média da camada dupla de pele para onde a câmara de titânio será implantada.
E cranialmente e caudally fixar a dobra da pele com uma sutura de polipropileno. Aperte o outro lado da sutura em um rack de metal para levantar a pele dobrada. E ajuste a altura do rack para permitir que o mouse se sente confortavelmente.
Suturar o primeiro quadro da câmara de titânio por suturas de polipropileno sobre a borda superior à parte de trás da dobra dorsal da pele. Após a reconfirmação da sedação use uma tesoura fina para fazer pequenas incisões na pele. E passe os dois parafusos de conexão ligados à primeira metade da câmara de titânio através da base da dobra da pele.
Retire o mouse do rack e coloque o animal em posição lateral. Coloque a segunda metade de cortesia da câmara de titânio em cima dos 3 parafusos de conexão. E aplique manualmente uma leve pressão para passar esses parafusos através da segunda metade do quadro de titânio.
A camada de pele dobrada está agora entre as duas metades simétricas da estrutura de titânio. Em seguida, fixar ambas as peças simétricas com porcas de aço inoxidável. Utilizando um soco de biópsia padronizado de 2mL de diâmetro, marque a área da ferida no centro da pele, dentro da janela de observação da câmara de dobra da pele.
E use fórceps finos e tesouras para remover toda a epiderme e derme dentro da marca. Para criar uma ferida circular. Limpe a ferida quadrada de 3,5 a 4 milômetros com 0,5 mL de soro fisiológico estéril.
E cubra a ferida com uma mancha de vidro. Use o plier de anel de encaixe na câmara de titânio para fixar a mancha no lugar. E transfira imediatamente o mouse para o estágio de imagem de um estereótipo.
Em seguida, imagem a ferida em uma ampliação de 40X. Antes de colocar o mouse em uma gaiola com monitoramento até a recuperação completa. Depois de criar um arranhão usando uma ponta de pipeta de 200 micro litros como demonstrado, neste experimento representativo, células de ambos os genótipos migraram para a área de risco e fecharam a lacuna.
A migração celular foi então quantificada como a porcentagem de área de risco repovoada por células migratórias 6 horas após a realização do arranhão. Por exemplo, neste experimento migrando cav beta 3 explosões de fibra deficiente fechou a área de risco significativamente mais cedo do que explosões de fibras de ratos do tipo selvagem. Para confirmar o efeito dependente cav beta 3 observado em cav beta 3 explosões de fibra deficiente, explosões de fibras do tipo selvagem foram transfectadas com siRNA para baixo regular a proteína Cav beta 3.
Explosões de fibra tratadas com o Cav beta 3 siRNAs específicas se comportaram como explosões de fibra deficientes beta 3. Para comparar a cicatrização da ferida da pele entre ambos os genótipos, a área da ferida na câmara de dobra da pele foi fotografada logo após o ferimento. E a ferida foi imagens nas próximas duas semanas.
Os tamanhos das feridas foram medidos nas imagens e a área da ferida, em um determinado dia foi expressa como, a porcentagem da área inicial da ferida. Como esperado, a taxa de fechamento de feridas foi aumentada em camundongos deficientes cav beta 3 em comparação com controles do tipo selvagem. Certifique-se de aplicar a mesma pressão na ponta da pipeta, para cada arranhão e combinar os arranhões com as linhas marcadas na parte inferior da placa o mais de perto possível.
A janela de observação da câmara dorsal da dobra da pele pode ser aberta a qualquer momento durante o processo de cura. Permitindo a aplicação atual de diferentes compostos farmacologicamente ativos. Também é possível extir situar a área ferida em diferentes estágios do processo de cura.
Para análise bioquímica ou histológica de proteína molecular.
