Asilerin deri yaralarının tedavisine ihtiyacı var. İlaç tedavileri için hedef moleküllerinizi belirlemek için in vitro ve in vivo test sistemleri gereklidir. Uygun sistemler in vitro çizik teşp, ve in vivo dorsal cilt kat odası vardır.
Her ikisi de farmakolojik olarak aktif bileşiklerin yokluğunda ve varlığında hücre göçünü ve deri yara iyileşmesini izlemek için doğrudan ileri prosedürlerdir. Her iki teknik de doğrudan olmasına rağmen, araştırmacılar çizik uygulaması uygulamalıdır. Ve sırt derisi kat oda implantasyonu, ve güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için yaralanma.
Prosedürlerin gösterimi, klinik ve deneysel cerrahi enstitüsünden cerrah ve profesör Dr. Matthias Laschke tarafından yapılacaktır. İşleme başlamadan önce, her kültür için çizilme bölgesini çizgilemek için her kuyunun altında yatay bir çizgi ile hücre tipi başına bir altı iyi plaka işaretlemek için ultra ince bir kalıcı işaretçi kullanın. Sonraki plaka birincil lif patlamalar vahşi tip ve beta 3 eksik fareler izole, bir altı kuyu plaka 5 kez 10 iyi konsantrasyon başına beşinci lif patlamaları.
DMEM'in 2mL'sinde %10 fetal büyükbaş serum uymaktadır. Plakaları hücre tipi, genotip ve tarih ile etiketle. Ve plakaları 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Ertesi sabah ilgi her lipid tabanlı transfeksiyon reaktif 9 mikro litre ekleyin, tüp başına azaltılmış serum orta 150 mikro litre içeren bireysel mikro santrifüj tüpler. Tüp başına 150 mikro litre azaltılmış serum ortamı içeren transfeksiyon reaktifi başına ikinci bir mikro santrifüj tüpüne 1,5 mikro litre siRNA ekleyin. Ve transfeksiyon reaktif çözeltisi tek bir tüp ile her siRNA çözeltisi karıştırın.
Kısa bir süre girdap sonra 5 dakika boyunca 21 derece santigrat de karışımları yerleştirin. Kuluçka sırasında dikkatle her kuyuda supernate değiştirin. Kuyuların yan aşağı taze kültür orta 2.25mL ile.
Kuluçka sonunda uygun siRNA transfeksiyon reaktif karışımı 250 mikro litre ekleyin, hücrelerin her karşılık gelen kuyu içine akıllıca bırakın. Ve plakaları 72 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Hücreler %100 biraraya geldiğinde, her kuyudan kültür supernatant atın.
Ve 200 mikro litrelik pipet ucu confluent hücre monolayer çizik oluşturmak için kullanın. Her kuyunun altındaki işaretli yatay çizgiye dikey. Daha sonra her yaralıyı yıkama başına 2mL PPS ile 2 kez dikkatlice durulayın.
Hasarlı hücrelerden, gevşek hücrelerden veya çizik alandan enkaz dan serbest bırakılan faktörleri kaldırmak için. İkinci yıkamadan sonra her kuyuya yüzde 1 veya 10 serum ile takviye taze hücre kültürü orta 2mL ekleyin. Ve ışık mikroskobundaki her tabaktaki yaraların görüntülerini yakalayın.
10X büyütmede tırmalamadan hemen sonra. Sonra plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Önümüzdeki 30 saat için uygun deneysel zaman noktalarında görüntüleri yakalamaya devam.
Deneyin sonunda kültür 6, 10 ve 30 saat sonra ilk hücre serbest alan ve kalan alanı ölçmek. İlk çizilme alanına göre göç eden hücreler tarafından yeniden doldurulan çizilme alanının yüzdesini belirlemek için. Parmak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, vahşi türü veya beta üç nakavt C57 siyah altı fare, dikkatle dorsum tıraş.
Ve hayvanın gözlerine merhem uygulayın. Kalan tüyleri ortadan kaldırmak için tüy dökücü krem uygulayın. 10 dakika sonra krem çıkarmadan.
Titanyum haznesini hazırlamak için, simetrik titanyum oda çerçevesinin bir kısmını, somunlarla bağlantı vidaları ile sabitleyin. Haznenin iki simetrik parçası arasında 400 ila 500 mikrometre korumak. Deride kan vezikülleri sıkıştırma önlemek için.
Maruz kalan cildi %70 etanol ile dezenfekte edin. Ve bir ışık kaynağının önünde bir deri kıvrımı kavramak. Derinin çift tabakasının orta çizgisini titanyum haznesinin implante edileceği yere yerleştirin.
Ve kranially ve caudally bir polipropilen sütür ile cilt kıvrım düzeltmek. Katlanmış cildi kaldırmak için sütür diğer tarafını metal bir rafüzerinde sıkın. Ve farenin rahatça oturmasını sağlamak için rafın yüksekliğini ayarlayın.
Dorsal deri kıvrımının arkasına üstün kenarı polipropilen dikişler ile titanyum haznesinin ilk çerçevedikiş. Sedasyon yeniden doğruladıktan sonra deride küçük kesiler yapmak için ince makas kullanın. Ve titanyum haznesinin ilk yarısına bağlı iki bağlantı vidasını deri kıvrımının tabanından geçirin.
Fareyi raftan çıkarın ve hayvanı yanal bir konuma yerleştirin. Titanyum haznesinin ikinci ücretsiz yarısını 3 bağlantı vidasının üzerine yerleştirin. Ve el ile titanyum çerçevenin ikinci yarısından bu vidageçmek için hafif basınç uygulayın.
Katlanmış deri tabakası şimdi titanyum çerçevenin iki simetrik yarısı arasında sıkışmış. Sonra paslanmaz çelik fındık ile her iki simetrik parçaları düzeltmek. Standart 2mL çapında biyopsi yumruğu kullanarak, deri kıvrım odasının gözlem penceresi içinde, derinin merkezindeki yara alanını işaretleyin.
Ve işareti içinde tüm epidermis ve dermis kaldırmak için ince çerkes ve makas kullanın. Dairesel bir yara yaratmak için. 3,5 ila 4 buçuk milometre karelik yarayı 0,5 mL steril tuzlu su yla temizleyin.
Yarayı cam kapaklı bir kapakla kapatın. Yerine kapak düzeltmek için titanyum odasında snap ring plier kullanın. Ve hemen fareyi bir stereomikroskobun görüntüleme aşamasına aktarın.
Sonra yarayı 40X büyütmede görüntüle. Tam kurtarma kadar izleme ile bir kafesiçine fare yerleştirmeden önce. Gösterildiği gibi 200 mikro litrelik pipet ucu kullanılarak bir çizik oluşturduktan sonra, bu temsili deneyde, her iki genotipten hücreler çizilme alanına göç etti ve boşluğu kapattı.
Hücre geçişi daha sonra çizik yapıldıktan 6 saat sonra göç eden hücreler tarafından yeniden doldurulan çizilme alanı yüzdesi olarak ölçüldü. Örneğin bu deneyde Cav beta 3 eksik lif patlamaları göç vahşi tip farelerden lif patlamaları önemli ölçüde daha erken çizik alanı kapattı. Cav beta 3'ün eksik lif patlamalarında gözlenen Cav beta 3 bağımlı etkisini doğrulamak için, yabani tip lif patlamaları Cav beta 3 proteinini aşağı doğru lamak için siRNA ile transfected edildi.
Cav beta 3 spesifik siRNA'larla tedavi edilen fiber patlamalar beta 3 eksik lif patlamaları gibi davrandı. Her iki genotip arasında deri yara iyileşmesi karşılaştırmak için, deri kıvrım odasında yara alanı doğrudan yaradan sonra fotoğraflandı. Ve yara sonraki 2 hafta içinde görüntülendi.
Görüntülerde yaraların boyutları ölçüldü ve yara alanı, belirli bir günde ilk yara alanının yüzdesi olarak ifade edildi. Beklendiği gibi cav beta 3 eksik farelerde yara kapatma oranı yabani tip kontrollere göre artırıldı. Her çizik için pipet ucuna eşit basınç uyguladığından ve çizikleri plakanın altındaki işaretli çizgilerle mümkün olduğunca yakından eşleştirdiğinden emin olun.
Dorsal deri kıvrım odasının gözlem penceresi iyileşme sürecinde her zaman açılabilir. Farmakolojik olarak aktif bileşiklerin topikal uygulamasına izin vermek. Ayrıca iyileşme sürecinin farklı aşamalarında yaralı bölgeyi çıkarmak da mümkündür.
Moleküler protein biyokimyasal veya histolojik analizi için.
