Este protocolo ofrece la oportunidad de armonizar los estudios que utilizan el modelo de lesión de percusión de fluido lateral de rata de lesión cerebral traumática en combinación con la grabación de EEG a través de telemetría inalámbrica. Se puede utilizar para investigar los factores que influyen en la epileptogénesis postraumática y para probar el potencial neuroterapéutico de las intervenciones farmacológicas, lo que puede prevenir el desarrollo de epilepsia postraumática. Este enfoque permite la grabación de vídeo EEG de larga duración de ratas en movimiento libre y permite la manipulación moderada de los animales sin la interrupción de la grabación de EEG.
Demostrando el procedimiento estará Matthew McGuire, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Consulte el manuscrito que acompaña a este protocolo para conocer los procedimientos quirúrgicos detallados. Haga una incisión de línea media de 1 1/2 a 2 1/2 centímetros a través de la piel y el músculo del cuero cabelludo usando una cuchilla de bisturí número 10.
Retirar la piel y el músculo para exponer el cráneo y proporcionar un campo quirúrgico claro. La electrocauterización es útil para lograr una hemostasia rápida. A continuación, afeita la cresta lateral del hueso parietal izquierdo usando una cureta quirúrgica para producir una superficie lisa y plana de modo que la base del cubo de bloqueo Luer hembra-hembra pueda descansar al ras con el cráneo.
Irrigar la superficie del cráneo y los tejidos circundantes con 2,0 miligramos por mililitro de solución de gentamicina en solución salina estéril, y eliminar el exceso de solución con hisopos estériles. Luego, aplica 3%peróxido de hidrógeno en el cráneo para secar el hueso. En este punto, cree un sitio de craniectomía de cinco milímetros de diámetro a través del hueso parietal izquierdo.
A continuación, retire el colgajo óseo con la cureta quirúrgica y los fórceps de tejido liso. A continuación, con un microscopio estéreo, retire suavemente el borde delgado del hueso que queda con fórceps de tejido liso, teniendo cuidado de no romper la dura. Luego, frota el cráneo con 70%etanol para eliminar cualquier polvo óseo y secar el cráneo.
Aplique una fina capa de pegamento de cianoacrilato alrededor del borde inferior del cubo de bloqueo Luer, y fíjelo al cráneo sobre la craniectomía sin obstruir la abertura y sin permitir que el pegamento entre en contacto con la dura. A continuación, selle la cerradura Luer en su lugar con una fina capa de pegamento alrededor de la base exterior del cubo. A continuación, prepare una suspensión de cemento dental y aplíquela a la superficie del cráneo alrededor y sobre la base del cubo de bloqueo Luer para asegurarlo en su lugar.
A continuación, llene el cubo de bloqueo Luer con una solución estéril libre de conservantes que contenga varios electrolitos, utilizando una jeringa y una aguja. Se debe ver un bolo convexo de solución salina por encima de la parte superior del borde. Una vez que el cemento dental está completamente curado, deje de hacer la anestesia gaseóstica y retire la rata del marco estereotaxico.
Coloque la rata en una plataforma junto al dispositivo de lesión de percusión fluida en la reclinación esternal. A continuación, fije una longitud de 12 centímetros de tubo de presión hasta el final de la punta curva del dispositivo, con el extremo opuesto terminando en un conector de giro de bloqueo Luer macho de dos centímetros. Asegure la rata al dispositivo conectando el extremo hembra del cubo en el cráneo de la rata al conector macho.
Compruebe repetidamente que el animal devuelva el reflejo de abstinencia. Tan pronto como la rata recupere el reflejo de abstinencia pero todavía esté sedado, suelte el péndulo del dispositivo para causar un solo pulso de presión de 20 milisegundos e induzca lesiones. Luego, desconecte inmediatamente la rata del dispositivo FPI, colóquela en la reclinación esternal y proporcione oxígeno suplementario a través de un cono nasal hasta que vuelva la respiración espontánea.
Tenga en cuenta que la apnea es una consecuencia anticipada de la lesión. Si es necesario, proporcione respiraciones manuales periódicas a través de una máscara de válvula de bolsa hasta que la rata comience a respirar espontáneamente por sí misma. Supervise continuamente y registre el tiempo de retorno del reflejo corrector.
Cuatro horas después de la lesión, de nuevo anestesiar a la rata, y colocarlo de nuevo en el marco estereotáctico para quitar el cubo de bloqueo Luer y cemento dental. Aplicar una pequeña gota de 0.5%bupivacaína clorhidrato al cráneo en cada uno de los lugares donde se deben perforar cinco agujeros piloto. A continuación, taladre los agujeros piloto a través del cráneo con una broca de mano de 0,1 milímetros.
A continuación, fije los tornillos de electrodo de acero inoxidable. En primer lugar, coloque un tornillo de referencia caudal a la lambda, sobre el cerebelo. A continuación, coloque los electrodos de grabación en los cuatro lugares como se ve aquí.
Asegúrese de frotar el cráneo con 70%etanol para eliminar cualquier polvo óseo. Luego, cubra el sitio de la craniectomía con una capa delgada de cera ósea estéril para cubrir la dura expuesta. Ahora, conecte una matriz de electrodos a los cinco electrodos EEG envolviendo el extremo expuesto de un alambre de electrodo codificado por colores firmemente alrededor de su tornillo de electrodo de acero inoxidable designado.
Recoger los cables de electrodos en una bobina debajo del pedestal, y asegurar los cables y pedestal en su lugar con cemento óseo. Mantenga el pedestal en posición hasta que el cemento óseo se haya curado. Por último, conecte el transmisor inalámbrico con baterías nuevas al pedestal antes de retirar el animal del marco estereotáctico.
A partir del día de la lesión, utilice el software de recolección del fabricante del EEG para grabar continuamente el EEG de vídeo, vinculando cada transmisor inalámbrico a través de una frecuencia única a un receptor específico. Graba vídeo de cada rata con su propia cámara configurada para grabar a 30 fotogramas por segundo. A continuación, atraque manualmente las grabaciones del EEG para identificar los eventos de índice que definen la actividad de convulsiones.
Esta cifra muestra la desaceleración unilateral e intermitente del delta recogida el día de un TBI moderado. Aquí, vemos un rastro de EEG de 90 segundos de una rata de control no lesionada y operada falsamente con análisis FFT de EPOC seleccionado de 2.048 milisegundos. Luego, aquí vemos un rastro EEG de un animal moderadamente lesionado, lo que demuestra el patrón intermitente y unilateral de desaceleración delta y el análisis FFT de EPOC seleccionado de 2.048 milisegundos.
Esta cifra muestra la desaceleración del delta bilateral y continua recogida el día de un TBI grave, utilizando las mismas técnicas de análisis. Aquí, vemos un rastro de EEG de 90 segundos, que demuestra el patrón de desaceleración delta bilateral continuo de un animal gravemente herido. Aquí, vemos actividad de convulsiones electrográficas no convulsivas recogida tres días después de la TBI grave.
Se muestran los datos de una rata de control tres días después de la cirugía, así como un seguimiento de EEG de 90 segundos tres días después de una lesión grave, y un análisis FFT de una EPOC seleccionada de 2,048 milisegundos. Y finalmente, esta figura muestra la convulsa actividad de convulsiones electrográficas recogidas nueve días después de la TBI, con el análisis FFT de este animal. Aquí, también vemos imágenes representativas de la caída intermitente ocasional de la señal y la pérdida de señal debido a un fallo de la batería.
Es importante asegurarse de que la dura no se interrumpa y permanezca intacta después de la craniectomía y que el cubo de bloqueo Luer esté sellado de forma segura en el cráneo. También es importante asegurarse de que los cables del electrodo hagan un buen contacto con los tornillos de grabación que se colocan en el cráneo. Por último, asegúrese de que el cráneo está libre de polvo y seco para asegurarse de que el cemento óseo se adhiere a la cabeza a largo plazo.
