Dieses Protokoll bietet die Möglichkeit, Studien zu harmonisieren, die das Ratten-Lateralfluid-Percussion-Verletzungsmodell traumatischer Hirnverletzungen in Kombination mit EEG-Aufnahmen über drahtlose Telemetrie verwenden. Es kann verwendet werden, um Faktoren zu untersuchen, die die posttraumatische Epileptogenese beeinflussen, und das neurotherapeutische Potenzial von Arzneimittelinterventionen zu testen, die die Entwicklung einer posttraumatischen Epilepsie verhindern können. Dieser Ansatz ermöglicht die langatterne Video-EEG-Aufzeichnung frei beweglicher Ratten und ermöglicht eine moderate Manipulation von Tieren ohne Unterbrechung der EEG-Aufnahme.
Demonstriert wird das Verfahren von Matthew McGuire, einem MD-Doktoranden aus meinem Labor. Ausführliche chirurgische Eingriffe finden Sie im Begleitmanuskript zu diesem Protokoll. Machen Sie einen 1 1/2 bis 2 1/2-Zentimeter Mittellinienschnitt durch die Haut und den Muskel der Kopfhaut mit einer Skalpellklinge der Nummer 10.
Ziehen Sie die Haut und den Muskel zurück, um den Schädel freizulegen und bieten Sie ein klares operationsesopes Feld. Elektrokauterie ist nützlich, um eine schnelle Hämostase zu erreichen. Als nächstes rasieren Sie den seitlichen Grat des linken Parietalknochens mit einer chirurgischen Kurette, um eine glatte, flache Oberfläche zu erzeugen, so dass die Basis der weiblich-weiblichen Luer-Verriegelungsnabe bündig mit dem Schädel ruhen kann.
Bewässern Sie die Schädeloberfläche und das umgebende Gewebe mit 2,0 Milligramm pro Milliliter Gentamicin-Lösung in steriler Kochsäure und bloten Sie überschüssige Lösung mit sterilen Tupfern. Dann 3% Wasserstoffperoxid auf den Schädel auftragen, um den Knochen zu trocknen. Erstellen Sie an dieser Stelle eine Kraniektomie-Stelle mit einem Durchmesser von fünf Millimetern durch den linken Parietalknochen.
Entfernen Sie dann die Knochenklappe mit der chirurgischen Kurette und glatten Gewebezangen. Als nächstes, mit einem Stereo-Mikroskop, sanft entfernen Sie die dünne Felge des Knochens mit glatten Gewebezangen, wobei darauf achten, nicht die Dura zu brechen. Dann wischen Sie den Schädel mit 70% Ethanol, um Knochenstaub zu entfernen und den Schädel zu trocknen.
Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylatkleber um den unteren Rand der Luer-Verriegelungsnabe auf und sichern Sie sie am Schädel über die Kraniektomie, ohne die Öffnung zu behindern und ohne zuzulassen, dass der Kleber die Dura in Kontakt stellt. Versiegeln Sie dann das Luer-Schloss mit einer dünnen Leimschicht um die Außenbasis der Nabe. Als nächstes bereiten Sie eine Gülle aus Zahnzement vor und tragen Sie diese auf die Oberfläche des Schädels um und über der Basis der Luer-Schleusennabe auf, um sie an Ort und Stelle zu sichern.
Füllen Sie dann die Luer-Verriegelungsnabe mit einer sterilen konservierungsfreien Lösung, die mehrere Elektrolyte enthält, mit einer Spritze und einer Nadel. Ein konvexer Bolus von Kochsaline sollte über der Oberseite der Felge gesehen werden. Sobald der Zahnzement vollständig ausgehärtet ist, beenden Sie die Gasanästhesie und entfernen Sie die Ratte aus dem stereotaxic Rahmen.
Legen Sie die Ratte auf eine Plattform neben dem Fluid Percussion Verletzungsgerät in Brustbein recumbency. Dann sichern Sie eine 12-Zentimeter-Länge von Druckschläuchen bis zum Ende der gekrümmten Spitze des Geräts, wobei das gegenüberliegende Ende in einem zwei Zentimeter großen, männlichen Luer-Verriegelungsverbinder endet. Sichern Sie die Ratte am Gerät, indem Sie das weibliche Ende der Nabe am Schädel der Ratte mit dem männlichen Stecker verbinden.
Überprüfen Sie das Tier wiederholt auf Rückgabe des Entzugsreflexes. Sobald die Ratte den Entzugsreflex wiedererlangt, aber immer noch sediert ist, lassen Sie das Pendel des Geräts los, um einen einzelnen Druckimpuls von 20 Millisekunden zu verursachen und Verletzungen auszulösen. Dann trennen Sie sofort die Ratte vom FPI-Gerät, legen Sie sie in die Brusthöhe und liefern Sie zusätzlichen Sauerstoff über einen Nasenkegel, bis die spontane Atmung zurückkehrt.
Beachten Sie, dass Apnoe eine vorweggenommene Folge der Verletzung ist. Falls erforderlich, geben Sie regelmäßige manuelle Atemzüge über eine Beutelventilmaske an, bis die Ratte spontan auf sich allein zu atmen beginnt. Überwachen Sie kontinuierlich, und erfassen Sie die Zeit der Rückkehr des Rechtenreflexes.
Vier Stunden nach der Verletzung, wieder besanten die Ratte, und legen Sie es wieder in den stereotaktischen Rahmen, um die Luer-Verriegelungnnabe und Zahnzement zu entfernen. Tragen Sie an jedem der Orte, an denen fünf Pilotbohrungen gebohrt werden sollen, einen kleinen Tropfen von 0,5%bupivacaine Hydrochlorid auf den Schädel auf. Dann bohren Sie die Pilotenlöcher durch den Schädel mit einem Hand-0,1-Millimeter-Bohrer.
Als nächstes befestigen Sie die Edelstahl-Elektrodenschrauben. Legen Sie zunächst eine Referenzschraube kaudal zum Lambda, über das Kleinhirn. Platzieren Sie dann aufnahmeelektroden an den vier Orten, wie hier zu sehen.
Achten Sie darauf, den Schädel mit 70% Ethanol zu wischen, um Knochenstaub zu entfernen. Dann bedecken Sie die Kraniektomie-Stelle mit einer dünnen Schicht sterilen Knochenwachs, um die freiliegende Dura zu bedecken. Schließen Sie nun ein Elektrodenarray an die fünf EEG-Elektroden an, indem Sie das freiliegende Ende eines farbcodierten Elektrodendrahts eng um die dafür vorgesehene Edelstahl-Elektrodenschraube wickeln.
Sammeln Sie die Elektrodendrähte in eine Spule unter dem Sockel und sichern Sie die Drähte und den Sockel mit Knochenzement an Ort und Stelle. Halten Sie den Sockel in Position, bis der Knochenzement ausgehärtet ist. Schließlich befestigen Sie den Funksender mit frischen Batterien am Sockel, bevor Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen entfernen.
Verwenden Sie ab dem Tag der Verletzung die Sammlungssoftware des EEG-Herstellers, um kontinuierlich Video-EEG aufzuzeichnen und jeden drahtlosen Sender über eine eindeutige Frequenz mit einem bestimmten Empfänger zu verbinden. Nehmen Sie Videos jeder Ratte mit einer eigenen Kamera auf, die so konfiguriert ist, dass sie mit 30 Bildern pro Sekunde aufzeichnet. Überprüfen Sie manuell die EEG-Aufzeichnungen, um Indexereignisse zu identifizieren, die die Anfallsaktivität definieren.
Diese Abbildung zeigt eine einseitige, intermittierende Verlangsamung des Deltas, die am Tag eines moderaten TBI gesammelt wurde. Hier sehen wir eine 90-Sekunden-EEG-Spur einer scheinbetriebenen, unverletzten Kontrollratte mit FFT-Analyse von 2, 048-Millisekunden ausgewähltem EPOC. Dann sehen wir hier eine EEG-Spur eines mittelschwer verletzten Tieres, die das intermittierende, einseitige Delta-Verlangsamungsmuster und die FFT-Analyse von 2, 048-Millisekunden ausgewähltem EPOC zeigt.
Diese Abbildung zeigt bilaterale, kontinuierliche Deltaverlangsamung, die am Tag eines schweren TBI mit den gleichen Analysetechniken gesammelt wurde. Hier sehen wir eine 90-Sekunden-EEG-Spur, die das kontinuierliche, bilaterale Delta-Verlangsamungsmuster eines schwer verletzten Tieres zeigt. Hier sehen wir nicht krampfhafte elektrografische Anfallsaktivität, die drei Tage nach dem schweren TBI gesammelt wurde.
Daten einer Kontrollratte drei Tage nach der Operation werden gezeigt, sowie eine 90-Sekunden-EEG-Spur drei Tage nach schwerer Verletzung und FFT-Analyse eines 2, 048-Millisekunden ausgewählten EPOC. Und schließlich zeigt diese Abbildung krampfhafte elektrografische Anfallsaktivität, die neun Tage nach TBI gesammelt wurde, mit FFT-Analyse von diesem Tier. Hier sehen wir auch repräsentative Bilder von gelegentlichen intermittierenden Signalausfällen und Signalverlust aufgrund eines Batterieausfalls.
Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Dura nicht gestört wird und nach der Kraniektomie intakt bleibt und dass die Luer-Schleusennabe sicher am Schädel versiegelt ist. Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass die Elektrodendrähte guten Kontakt mit den Aufnahmeschrauben, die im Schädel platziert sind. Schließlich stellen Sie sicher, dass der Schädel staub- und trocken ist, um sicherzustellen, dass der Knochenzement langfristig am Kopf haftet.
