Este protocolo nos ayuda a entender cómo se produce el comportamiento del citoesqueleto de Microtúbulo en las plantas. Al mismo tiempo, también nos ayuda a entender cómo estos componentes estructurales que influyen en la forma celular y de los órganos, responden a los cambios en las fuerzas mecánicas. Aunque, este método requiere poca sofisticación, proporciona lectura robusta y cuantitativa, las diferencias de respuesta mecánica entre diferentes genotipos y condiciones.
Comience por cultivar semillas de arabidopsis que expresen dominios de unión de microtúbulos fusionados con proteína fluorescente verde en el suelo, a 20 y 6 grados centígrados en condiciones de día largo durante una semana. Después de la germinación, transfiera las plántulas a nuevas macetas con suficiente espacio de crecimiento para permitir un crecimiento vegetativo robusto, y coloque las plantas en 20 y 16 grados centígrados en condiciones de día corto. Después de tres a cinco semanas, transfiera las plantas a condiciones de día largo a la misma temperatura hasta que las plantas se atornillen, permitiendo que la inflorescencia crezca hasta dos a cinco centímetros de largo.
Para la disección Shoot Apical Meristem, putt la inflorescencia, y utilizar fórceps afilados para pelar las flores en la base de los pedúnculos, hasta que es difícil ver los pedúnculos a simple vista para eliminar los brotes de flores más antiguos. Utilice los fórceps para crear una hendidura en los agros en un plato diseccionador, y plantar la base de inflorescencia en el grueso Augur. Coloque el plato debajo de un microscopio de disección.
Comenzando con el brote de flor más antiguo, empuje con los fórceps para eliminar el brote de la flor de la planta. El brote de meristem apical generalmente se expone cuando se retiran flores más viejas hasta la etapa seis a siete. Y usa los fórceps para empujar cada brote de flores hacia abajo hasta que el brote apical meristem sea visible.
Tan pronto como se exponga el meristem apical de brote, deje que la muestra recién diseccionada en el medio de crecimiento en una caja de cultivo con bisagras de plástico rectangular esterilizado con etanol con el meristem apical de brote acaba de exponer por encima de la superficie media. Agregue unas gotas de agua estéril desionizada a los bordes de la caja de cultivo y cierre la tapa para mantener la humedad dentro de la caja. Envuelva la caja con cinta adhesiva de micropore y coloque la caja de crecimiento en condiciones diurnas largas o continuas a 22 grados Centígrados durante 12 a 24 horas.
Cuando la planta se haya recuperado del procedimiento de disección, cubra la muestra con agua estéril desionizada y compruebe si hay burbujas de aire bajo el microscopio de disección. Transfiera la caja de cultivo a una etapa de microscopio confocal vertical y seleccione la lente de inmersión de agua 40 o 60X. Baje el objetivo en el agua y compruebe si hay burbujas de aire en la lente frontal del objeto.
Para eliminar las burbujas, baje el escenario y limpie suavemente la lente con un tejido óptico. A continuación, utilice una pipeta Pasteur para añadir un pequeño volumen de agua a la lente frontal del objetivo antes de volver a sumergir la lente en el agua. A continuación, utilice el filtro GFP y el módulo de epi-iluminación del microscopio confocal para ajustar el controlador XY para localizar la muestra.
Ajuste de la posición de los oculares, coloque el meristem apical de disparo directamente debajo de la fuente de luz y enfoque a lo largo del eje Z hasta que se encuentre el ápice. Utilice un láser capaz de emocionante GFP para iluminar la muestra, y ajustar el zoom óptico del microscopio, de modo que todo el brote apical meristem y la etapa una primordia floral están en el campo de visión. A continuación, ajuste la potencia de la salida láser y los ajustes de ganancia para obtener una relación señal-ruido óptima.
Después de permitir que la muestra se asiente durante dos a cinco minutos, adquiera pilas Z confocales de la muestra a intervalos de rodajas Z de 0,25 a 0,5 micrómetros, añadiendo aproximadamente 0,3 micrometros de resolución de tamaño de píxeles. Al final de la adquisición, retire inmediatamente el agua y transfiera la caja de cultivo de vuelta a la cámara de crecimiento. Para Micromechanical Shoot Apical Meristem Perturbation, adquiera pilas de imágenes de preablación de la organización de microtúbulos corticales como acaba de demostrar, y descafeinar el agua de la caja de cultivo en un plato de cultivo.
Transfiera el meristem apical de disparo bajo un microscopio diseccionado, y lentamente se acercó al meristem apical de brote con una aguja limpia de jeringa de 0,4 por 20 milímetros. Póngase en contacto brevemente con la periferia de la cúpula del meristem apical de disparo con la punta de la aguja para confirmar que se ha completado la ablación. Y rellene el plato de cultivo con agua estéril desionizada.
A continuación, añadir 10 microgramos por mililitro de yoduro propidio al plato y adquirir inmediatamente pilas de imagen como se demuestra cada dos horas durante seis horas, devolviendo el plato de cultivo a la incubación entre cada punto de tiempo. Para el análisis de datos, genere proyecciones de superficie de las pilas de imágenes utilizando un programa de software de análisis de imágenes adecuado y realice la extracción de la anisotropía de microtúbulos corticales utilizando la macro de herramientas fibril en Fiji. Aquí, se pueden observar imágenes de proyección típicas obtenidas de líneas GFP de dominio de unión de microtúbulos con celdas en el centro de la cúpula que contienen microtúbulos corticales desorganizados, celdas en la periferia, que tienen una distribución circunferencial y celdas de dominio de límite que contienen microtúbulos corticales alineados en paralelo al eje largo de la célula.
La imagen de lapso de tiempo, muestra la alineación de los microtúbulos corticales que cambia de una matriz altamente desordenada a una matriz más organizada dentro de las seis horas de la ablación. Los tensores podrían ser superpuestos en las imágenes de microtúbulos corticales, y la información extraída podría representarse trazando la anisotropía media a lo largo del tiempo. Al ajustar la potencia de salida del láser y los ajustes de ganancia, debemos asegurar la observación clara de los filamentos y tratar de evitar la sobreexposición, ya que sobre las señales saturadas podría sesgar la dirección de tracción en análisis posteriores.
La microscopía de fuerza atómica también se puede realizar para evaluar cómo los cambios en las fuerzas mecánicas afectan realmente el estado físico de la pared celular.
