Nuestro protocolo es una técnica de separación epidérmica-dérmica fácil de usar y económica para determinar la producción específica del sitio de mediadores inflamatorios y neurotrofinas durante la inflamación de la piel. La principal ventaja de esta técnica es que la separación enzimática de la epidermis de la dermis se realiza a cuatro grados centígrados, manteniendo la integridad del ARNm y la proteína. Este método proporciona información sobre los tipos de mediadores que sensibilizan los terminales aferentes primarios durante la inflamación aguda y crónica para el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.
La cicatrización de heridas, enfermedades de la piel, heridas crónicas y quemaduras podrían beneficiarse de esta investigación. Y este método podría aplicarse a otras superficies epiteliales, como el tracto gastrointestinal y la córnea. El tiempo óptimo de separación puede diferir ligeramente entre los laboratorios.
Se recomienda un experimento preliminar que compare diferentes puntos de tiempo combinados con una evaluación de morfología 2D para determinar la calidad de la separación. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedaleo en una rata Sprague Dawley anestesiada de ocho a nueve semanas de edad, inyecte por vía subcutánea la pata trasera glabra derecha con 100 microlitros de carragenina Lambda 1X diluida en PBS. Use pinzas para medir el grosor del metatarsiano de la pata trasera inmediatamente antes y a las 6 y 12 horas después de la inyección para determinar el volumen de edema en respuesta al estímulo.
En el punto final experimental apropiado, use un bisturí afilado para cosechar una pieza de uno por dos milímetros de piel glabra de la pata trasera glabra de la pata inyectada y use fórceps de microdisección para transferir la piel a un mililitro de DMEM frío en un tubo de microcentrífuga en hielo durante 15 a 60 minutos. Mientras el tejido se está incubando, agregue un mililitro de termolisis activada recién preparada a 10 pozos de una placa de cultivo celular de 24 pozos en hielo. Al final de la incubación, use las pórceps de microdisección para transferir una muestra de piel a cada pocillo de termoisina activada, con el estrato córneo hacia arriba sin sumergir las muestras en la solución.
Es fundamental que la piel no esté inmersa en la termolisis y que el estrato córneo se ensañe hacia arriba para lograr una separación efectiva. Después de dos o tres horas, use las pórceps de microdisección para sumergir una muestra de piel en siete a ocho mililitros de cuatro grados Celsius DMEM en una placa de Petri para permitir más espacio para que la epidermis se separe de la dermis. Use forrceps para cepillar suavemente la epidermis alrededor del perímetro de la piel hasta que se observe la epidermis casi translúcida en los bordes de la muestra.
Cuando la epidermis se separa notablemente de la dermis, agarre cuidadosamente cada capa de piel con un solo par de pórceps y tire lentamente de la epidermis de la dermis, luego evalúe la translucidencia de la epidermis aislada mediante microscopía de luz para asegurarse de que sea ópticamente consistente. Si las capas se han separado correctamente, coloque los tejidos epidérmicos y dérmicos en recipientes individuales de EDTA de cinco milimolares en DMEM a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Después de la desactivación de la termoisina, fije una porción de la epidermis en un fijador apropiado durante una hora a temperatura ambiente con agitación.
Al final de la incubación, coloque el tejido fijo en sacarosa al 10% en PBS durante una hora a temperatura ambiente con agitación, antes de congelar la muestra en una matriz de incrustación de tejido adecuada para la sección. Use un criostato para obtener secciones transversales de 14 micrómetros de espesor y monte las secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de gelatina. Después de secarse en un calentador deslizante, manche las muestras con una solución de trabajo de azul de toluidina durante 90 segundos.
Después, lave suavemente el azul toluidina de las diapositivas con PBS y oponga los cubrebocas con un medio de montaje acuoso, luego observe la epidermis con microscopía Brightfield a un aumento de 50 a 250X. La inyección de carragenina en la pata trasera de la rata causa síntomas clásicos de inflamación, como enrojecimiento y edema a las 6 y 12 horas después de la inyección. La microscopía de campo brillante se puede utilizar para evaluar la eficacia de la separación de termolizsina de la epidermis y la dermis de la piel de la pata trasera glabra de la rata.
De hecho, la tinción azul toluidina de las secciones transversales epidérmicas muestra que la epidermis está separada de la dermis en la membrana basal, pero que las crestas epidérmicas de Rete y las hendiduras de la papila dérmica permanecen intactas. Además, se observan todas las capas de células de queratinocitos. Western blotting de la epidermis separada por termolysin produce resultados consistentes, indicando niveles estables de proteínas durante la técnica a cuatro grados centígrados.
Se detecta muy poca proteína NGF en la epidermis de rata ingenua, pero los niveles de proteína NGF están significativamente regulados después de seis horas de inflamación inducida por carragenina. 12 horas después de la inyección, los niveles de NGF se reducen en comparación con los observados a las seis horas, pero permanecen elevados en relación con los controles. Como se esperaba del análisis de Western blot, la inmunorreactividad ngF no se detecta en muestras de tejido de epidermis de control naïve, pero a las seis horas después de la inflamación inducida por carragenina, se observa inmunorreactividad NGF en la mayoría de los queratinocitos del estrato granuloso y el estrato lúcido.
Algunas células en el estrato espinoso también son inmunorreactivas NGF. Cuando se utiliza termolysin para aislar la epidermis intacta, es importante recordar que el tiempo óptimo de separación debe ser determinado empíricamente por el usuario final. Se pueden utilizar diversas técnicas proteómicas y moleculares para validar la expresión de proteínas específicas y/o transcripciones de genes primarios para confirmar que este procedimiento no altera la expresión basal.
Esta técnica de separación epidérmica-dérmica permitirá a los investigadores responder preguntas adicionales sobre la expresión site-specific de neurotrofinas y mediadores inflamatorios en diferentes modelos inflamatorios cutáneos. El ácido pícrico y el paraformaldehído son peligrosos. Trabaje con ambos productos químicos en una campana de humos, use ropa y guantes de protección personal y lávese la cara y las manos después de la manipulación.
