Nosso protocolo é uma técnica de separação epidérmico-dérmica fácil de usar e barata para determinar a produção específica do local de mediadores inflamatórios e neurotropinas durante a inflamação da pele. A principal vantagem dessa técnica é que a separação enzimática da epiderme da derme é realizada a quatro graus Celsius, mantendo a integridade do mRNA e da proteína. Este método fornece uma visão dos tipos de mediadores que sensibilizam terminais primários diferentes durante inflamações agudas e crônicas para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas.
Cicatrização de feridas, doenças da pele, feridas crônicas e queimaduras podem se beneficiar desta pesquisa. E esse método poderia ser aplicado a outras superfícies epiteliais, como o trato GI e a córnea. O tempo ideal de separação pode diferir ligeiramente entre os laboratórios.
Recomenda-se um experimento preliminar comparando diferentes pontos de tempo combinados com uma avaliação de morfologia 2D para determinar a qualidade da separação. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato Sprague Dawley de oito a nove semanas de idade, injete subcutânea a pata traseira glabrous direita com 100 microliters de 1X Lambda carrageenan diluído na PBS. Use pinças para medir a espessura metatarsal da pata traseira imediatamente antes e às 6 e 12 horas após a injeção para determinar o volume de edema em resposta ao estímulo.
No ponto final experimental apropriado, use um bisturi afiado para colher um pedaço de uma por dois milímetros de pele de pata traseira glabrous da pata injetada e use fórceps de microdisseção para transferir a pele em um mililitro de DMEM frio em um tubo de microcentrifuge no gelo por 15 a 60 minutos. Enquanto o tecido está incubando, adicione um mililitro de termolysina ativada recém-preparada a 10 poços de uma placa de cultura celular de 24 poços no gelo. Ao final da incubação, utilize os fórceps de microdisseção para transferir uma amostra de pele para cada poço de termolysina ativada, estrato corneum lado para cima sem imergir as amostras na solução.
É fundamental que a pele não esteja imersa na termolise e que o estrato corneum enfrente para alcançar uma separação eficaz. Após duas a três horas, use os fórceps de microdisseção para imergir uma amostra de pele em sete a oito mililitros de quatro graus Celsius DMEM em uma placa de Petri para permitir mais espaço para a epiderme se separar da derme. Use fórceps para escovar suavemente a epiderme ao redor do perímetro da pele até que a epiderme quase translúcida seja observada nas bordas da amostra.
Quando a epiderme se separa visivelmente da derme, segure cuidadosamente cada camada da pele com um único par de fórceps e puxe lentamente a epiderme da derme, então avalie a translucência da epiderme isolada por microscopia leve para garantir que ela seja opticamente consistente. Se as camadas tiverem sido devidamente separadas, coloque os tecidos epidérmicos e dérmicos em recipientes individuais de cinco milimalmente EDTA em DMEM a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a desativação da termolise, fixar uma parte da epiderme em um fixador apropriado por uma hora em temperatura ambiente com agitação.
Ao final da incubação, coloque o tecido fixo em 10% de sacarose em PBS durante uma hora em temperatura ambiente com agitação, antes de congelar a amostra em uma matriz adequada de incorporação de tecido para secção. Use um criostat para obter seções transversais de 14 micrômetros de espessura e descongelar as seções em lâminas de microscópio de vidro revestidas de gelatina. Depois de secar em um aquecedor de slides, manche as amostras com uma solução de trabalho de azul toluidina por 90 segundos.
Depois, lave suavemente o azul toluidina dos slides com PBS e oponha a deslizamentos com um meio de montagem aquoso, em seguida, observe a epiderme com microscopia Brightfield a uma ampliação de 50 a 250X. A injeção de carrageenano na pata traseira do rato causa sintomas clássicos de inflamação, como vermelhidão e edema em 6 e 12 horas após a injeção. A microscopia brightfield pode ser usada para avaliar a eficácia da separação termolise da epiderme e derme da pele da pata traseira glabrous ratazana.
De fato, a coloração azul toluidina das seções transversais epidérmicas mostra que a epiderme está separada da derme na membrana da linha de base, mas que as cristas epidérmicas de Rete e as recuos da papila dérmica permanecem intactas. Além disso, todas as camadas celulares queratinadas são observadas. A mancha ocidental da epiderme separada da termolise produz resultados consistentes, indicando níveis de proteínas estáveis durante a técnica a quatro graus Celsius.
Muito pouca proteína NGF é detectada na epiderme de ratos ingênuos, mas os níveis de proteína NGF são significativamente elevados após seis horas de inflamação induzida por carrageenano. 12 horas após a injeção, os níveis de NGF são reduzidos em comparação com os observados em seis horas, mas permanecem elevados em relação aos controles. Como esperado da análise de manchas ocidentais, a imunoreatividade NGF não é detectada em amostras de tecido de epiderme de controle ingênuo, mas em seis horas de inflamação pós-carrageenana induzida, a imunoreatividade NGF é observada na maioria dos queratinócitos do estrato granuloso e estrato lúdico.
Algumas células no spinosum estrato também são imunoreativas NGF. Ao usar termolise para isolar a epiderme intacta, é importante lembrar que o tempo ideal de separação deve ser determinado empiricamente pelo usuário final. Várias técnicas proteômicas e moleculares podem ser usadas para validar a expressão de proteínas específicas e/ou transcrições genéticas primárias para confirmar que este procedimento não altera a expressão basal.
Esta técnica de separação epidérmico-dérmica permitirá aos pesquisadores responder a perguntas adicionais sobre a expressão específica do local de neurotrophins e mediadores inflamatórios em diferentes modelos inflamatórios cutâneos. Ácido picrico e paraformaldeído são perigosos. Trabalhe com ambos os produtos químicos em um capô de fumaça, use roupas de proteção pessoal e luvas e lave o rosto e as mãos após o manuseio.
