Este protocolo facilita el aislamiento de subconjuntos de fibroblastos funcionalmente distintos de la piel humana mediante la clasificación FAC basada en la expresión del marcador de superficie celular. Por primera vez, los fibroblastos papilares y reticulares se pueden aislar directamente de la piel sin manipulación in vitro. Este es un gran avance en comparación con los métodos de aislamiento previamente establecidos utilizando cultivos explantados.
Los subconjuntos de fibroblastos dérmicos albergan funciones distintas en condiciones homeostáticas. Con esta herramienta, es posible investigar las diferencias funcionales en las patologías de la piel, incluyendo el cáncer o enfermedades inflamatorias de la piel. Dado que el manejo del tejido humano requiere cierta práctica para lograr rendimientos celulares satisfactorios, nos gustaría proporcionar una demostración visual para facilitar y acelerar este proceso.
Para preparar la dermis de espesor completo, coloque un pedazo de piel humana sobre un papel de filtro grueso con la epidermis hacia abajo. Sostenga la epidermis firmemente con fórceps y raspe la capa de grasa subcutánea con un bisturí. Luego, corta el tejido en tiras de cinco milímetros de ancho antes de ponerlos en un plato de Petri.
Para sedificar la dermis en capas papilares y reticulares, coloque un pedazo de piel sobre un papel de filtro grueso con la epidermis hacia arriba. Sostenga la piel firmemente sobre sus bordes con fórceps y corte una sección de 300 micrómetros de espesor con un dermatoma eléctrico. Transfiera la primera capa que consiste en epidermis y dermis papilar a un plato de Petri.
Luego, proceda inmediatamente a separar la epidermis y la dermis, o agregue 1x PBS para evitar que el tejido se seque. A continuación, ajuste el dermatome a un espesor de corte de 700 micrómetros y corte la dermis restante. Coloque la rebanada superior, que se define como la dermis reticular superior, en un plato de Petri separado.
Posteriormente, raspa la capa de grasa subcutánea con un bisturí de la capa dérmica reticular inferior residual, y deséchala. Recoger la dermis reticular inferior en otro plato de Petri. Proceda inmediatamente al procedimiento de digestión enzimática, o agregue 1x PBS para evitar que el tejido se seque.
Para realizar la digestión enzimática, coloque las tiras cutáneas de cinco milímetros o la dermis epidermis/papilar con la epidermis hacia arriba en una placa Petri con 10 mililitros de la solución enzimática disociante. Luego, incuba el plato Petri a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, transfiera la dermis epidermis/papilar a la tapa del plato Petri.
Separe la epidermis de la dermis superior con dos fórceps, cada uno sosteniendo el borde de la dermis. Posteriormente, picar cada capa dérmica tan a fondo como sea posible. Cuanto más pequeñas son las piezas, mejor será la digestión del tejido.
Luego, prepara la mezcla de digestión. Transfiera el tejido picado con 10 milímetros de la mezcla de digestión preparada en un tubo de 50 milímetros. Incubar el tejido a 37 grados centígrados durante una hora bajo agitación.
Invierta el tubo varias veces durante la digestión. Para preparar una suspensión de una sola célula, detenga la digestión del tejido enzimático añadiendo 10 mililitros de fibroblastos medios al tejido digerido sobre hielo. A continuación, vierta el contenido de cada tubo a través de un colador de té inoxidable estéril regular, y recoja la suspensión celular en un plato limpio de Petri.
Lave el colador con un medio y machaque las piezas de tejido no digeridos con el borde de un émbolo de jeringa. Después, pipetee la suspensión celular recolectada a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Enjuague el colador celular con medio y recoja el flujo a través del mismo tubo.
Luego, centrifuga el tubo a 500 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y lave el pellet celular con cinco mililitros de medio fibroblasto. Repita el paso de centrifugación de nuevo.
Después, retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en un mililitro de tampón de lyis de Eritrocitos ACK. Deje las células en el tampón de la lelisis durante aproximadamente un minuto a temperatura ambiente. A continuación, detenga la lisis añadiendo nueve mililitros de 1x PBS con 10%FCS.
Centrifugar el tubo de nuevo a 500 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos, y desechar el sobrenadante posteriormente. Después de que las células se hayan manchado para la clasificación de FAC siguiendo los protocolos estándar, claplice tres subpoblaciones de fibroblastos en tubos de microcentrífuga separados llenos con 350 microlitros de tampón de lisis para aislamiento de ARN o 350 microlitros de medio de crecimiento de fibroblastos para el cultivo celular. Invierta los tubos inmediatamente, y coloque los tubos tampón de lisis en nitrógeno líquido, o coloque los tubos medios de crecimiento de fibroblastos en hielo.
Después de FACS, gire las células hacia abajo a 500 veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Luego, platina una cantidad igual de células en el medio de crecimiento de fibroblastos en un plato de cultivo celular de 24 pozos, y déjelas crecer hasta que alcancen el 70% de confluencia. A continuación, reemplace el medio celular cultivado por el medio de diferenciación de adipocitos y deje que las células se diferencien durante 14 días.
En el día de diferenciación 14, fije las células con 4%PFA durante 20 minutos. Lavar los pozos con 60%isopropanol, y dejar que se evapore por completo. Luego, tiñe las células con cinco mililitros de aceite filtrado Rojo O durante 20 minutos.
Después de 20 minutos, lave las células manchadas cuatro veces con agua destilada. Imagen de las células sumergidas en agua con un microscopio invertido a 10x aumento con luz transmitida. Este protocolo permite la identificación de tres poblaciones de fibroblastos en la piel humana, que presenta diferentes localizaciones intradérmicas, perfiles de expresión génica y funciones.
Los CD90 negativos CD90 positivos de FAP se enriquecen en la dermis papilar, mientras que el CD90 positivo FAP y el CD90 positivo FAP son más abundantes en la dermis reticular. Las tres subpoblaciones ordenadas muestran morfología típica de fibroblastos sobre el cultivo durante siete días. Curiosamente, se comportan de manera diferente en un ensayo de adipogénesis.
Después de 14 días en el cultivo, el CD90 negativo con FAP positivo no se diferencian en adipocitos, mientras que los CD90 positivos FAP y los CD90 positivos de FAP se someten fácilmente a la adipogénesis. El perfilado de expresión génica muestra que las células CD90 negativas FAP positivas expresan altos niveles de marcadores comúnmente atribuidos a fibroblastos papilares, como CD26, NTN y PDPN, mientras que las células CD90 positivas expresan los marcadores reticulares conocidos, como CD36, actina muscular lisa y PPAR-gamma a niveles altos. Concluimos que las células CD90 negativas positivas de FAP pertenecen a las células papilares y CD90-positivas pertenecen al linaje reticular.
La digestión funciona mejor si las piezas dérmicas se pican a fondo y se incuban en una cantidad suficiente de medio de digestión. Los subconjuntos de fibroblastos dérmicos son funcionalmente diversos. Explorar su función en el contexto de la patogénesis de la enfermedad allanará el camino para nuevas intervenciones diagnósticas y terapéuticas.
