El sistema organoide 3D se considera más relevante fisiológicamente que los ensayos 2D, y puede proporcionar información valiosa sobre la biología que de otro modo sería difícil de adquirir. Este es un sistema adaptable donde podemos probar manipulaciones farmacológicas y genéticas con menos tiempo y un coste significativamente menor que el uso de un enfoque in vivo. El ensayo de matriz es muy difícil de manejar, ya que se solidifica cuando alcanza la temperatura ambiente.
Sólo se puede extraer a través de una pipeta cuando es líquida y debe mantenerse sobre hielo. La integridad del anillo es importante mantener. Si la estructura se interrumpe, eso puede afectar negativamente el crecimiento organoide, y puede perder fácilmente material al cambiar de medio.
Comience este procedimiento con la preparación de células epiteliales de próstata basales y luminales de ratón como se describe en el protocolo de texto. Lavar el pellet celular en 500 microlitros de medios organoides de ratón, luego volver a suspender el pellet en una densidad celular de 1.000 células por microlitro. Para preparar mezclas maestras, mezclar células epiteliales suspendidas en medios organoides de ratón con gel de matriz para generar una mezcla final que contenga 25% de células en medios y 75%matriz de gel.
Dependiendo de la aplicación aguas abajo, las células basales se pueden chapar típicamente a una concentración de 100 a 2.000 células por cada 80 microlitros, mientras que las células luminosas se placan a una concentración de 2.000 a 10.000 células por cada 80 microlitros. Para cada mezcla celular, agregue 80 microlitros del gel de matriz por pozo de una placa de 24 pozos. Pipetear una gota en la mitad inferior de la pared del pozo evitando el contacto directo con el revestimiento de poli-hema.
Después de agregar el gel de matriz, gire la placa para permitir que la mezcla de células de gel de matriz forme un anillo alrededor del borde del pozo. Coloque la placa de 24 pozos en una incubadora de 37 grados Celsius, 5%C02 hacia arriba durante 10 minutos para permitir que el gel de matriz se endurezca parcialmente. Después de incubar durante 10 minutos, voltee la placa de 24 pozos boca abajo e incubar durante 50 minutos adicionales para permitir que el gel de matriz se endurezca por completo.
A continuación, agregue 350 microlitros de medios organoides de ratón precalentó en el centro de cada pozo. Después de añadir el medio, devuelva la placa de 24 pozos a la incubadora. Para reponer el soporte organoideo del ratón, incline la placa de 24 pozos en un ángulo de 45 grados y retire suavemente los medios existentes del centro de cada pozo utilizando una pipeta P1000 evitando el anillo de gel de matriz.
Agregue 350 microlitros de medios organoides de ratón precalentó como antes. Se recomienda añadir un mayor volumen de medios a los organoides cultivados durante más de cinco días para evitar el agotamiento rápido de nutrientes clave y factores de crecimiento. Retire el medio de cada pozo como de antes.
Para recoger organoides, explote repetidamente el gel de matriz pipeteando un mililitro de medios precalentados que contienen dispase directamente sobre el anillo de gel de matriz hasta que todo el anillo se desalojara. Transfiera la mezcla organoide de gel de matriz desprendido a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Después de la digestión completa como se describe en el protocolo de texto, agregue solución salina tamponada de fosfato al pellet organoide, y vuelva a suspender moviendo suavemente.
Pelecila los organoides por centrifugación a 800 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, y retire el sobrenadante usando una micro-pipeta. Vuelva a suspender los gránulos organoides en 100 microlitros de tampón de lysis proteica por cada 10 microlitros de volumen celular envasado. Flick para volver a suspender.
Ahora, sonicar los organoides sumergiendo tubos en hielo húmedo y aplicando suavemente la punta del desmembrador sónico en el exterior del tubo de microcentrífuga. Sonicar durante 40 segundos a 20 kilohercios antes de proceder a western blotting con protocolos establecidos. Para recoger organoides prostáticos de las placas de 24 pozos, retire el medio de cada bien como antes.
Digerir el gel de matriz incubando con 500 microlitros de medios que contienen dispase durante 30 minutos en una incubadora de 37 grados Celsius, 5%CO2. Recoger la suspensión organoide digerida en un tubo de micro centrífuga. Luego, pele el organoides por centrifugación a 800 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente, y retire el sobrenadante.
Para realizar la tinción inmunofluorescente de montaje integral de organoides prostáticos, primero agregue 500 microlitros de 4%paraformaldehído en PBS. Incubar los organoides durante dos horas a temperatura ambiente con un suave temblor. Después de lavar el pellet como se describe en el protocolo de texto, añadir un microgramo por mililitro de mancha DAPI en solución de bloqueo, e incubar durante dos horas a temperatura ambiente.
Proteja la muestra de la luz durante la incubación de este paso adelante. Después de la centrifugación de los organoides como antes, añadir anticuerpo primario en solución de bloqueo e incubar durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación suave. Pele el organoides de nuevo, y lavar el pellet con un milliter de PBS durante 15 minutos con agitación suave.
Repita este procedimiento de lavado dos veces. A continuación, agregue anticuerpos secundarios en la solución de bloqueo e incubar durante la noche a cuatro grados Centígrados con un suave temblor. Después de la incubación, pele el organoides, y lavar el pellet por dos veces más.
Añadir un mililitro de 30%sacarosa en PBS con 1%Tritón X-100 a los organoides peletados. Luego incubar durante dos horas a temperatura ambiente con un suave temblor. Después de peletizar los organoides de nuevo, agregue un milímetro de 45%sacarosa en PBS con 1%Tritón X-100, y agite suavemente durante dos horas a temperatura ambiente.
A continuación, repita el procedimiento, excepto añadir un mililitro de 60%sacarosa en PBS con 1%Triton X-100. Pele el organoides por centrifugación a 800 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente, y eliminar el 95% del sobrenadante. Observe el pellet bajo la luz UV para confirmar que no se perdió durante la eliminación del sobrenadante.
El pellet se vuelve más flojo a medida que la concentración de sacarosa se hace más alta. Transfiera de 10 a 20 microlitros de la suspensión restante a un cubreobjetos con cámara y proceda a una microscopía confocal. Las células basales y luminales forman organoides con morfologías distintas.
Mientras que la mayoría de los organoides de origen basal son similares en tamaño después de siete días en el cultivo, organoides derivados de la luminal exhiben heterogeneidad significativa. Además, la mayoría de los organoides de origen basal contienen lúmenes rodeados de epitelio multicapa, mientras que los organoides derivados de la luminal varían en morfología desde hueco con epitelio de una sola capa a sólido con cuerdas multicapa de células que no se canalizan. El análisis de manchas occidentales reveló que los organoides basales y de origen luminoso retienen características asociadas con células primarias basales y luminales.
Los organoides de origen basal expresan niveles más altos de la citoqueracina 5 del marcador basal, mientras que los organoides derivados de la luminal expresan niveles más altos de la citoqueracina 8 del marcador luminal. Tanto los marcadores basales como los luminosos se detectaron en organoides basales y derivados de la luminalidad en la población a granel, tal vez sugestiva de diferenciación. Los organoides de origen basal contienen epitelio multicapa, con capas externas que expresan altos niveles del marcador basal p63, y capas internas con niveles no detectables.
Las capas externas también expresan niveles moderados del marcador luminoso citokera 8, y las capas internas tienen altos niveles. Mientras que todas las células en organoides de origen luminal de una sola capa se tiñen positivamente para la citoqueracina 8, sólo las células selectas contenían p63 nuclear. Se debe tener cuidado al manipular el gel de matriz para asegurarse de que no se endurece antes de encolar las células en el cultivo organoide.
DAPI utilizado para la microscopía puede causar irritación de la piel. La luz UV también puede ser dañina. Un equipo de protección personal adecuado es esencial.
Podemos recoger el ARN de los organoides para realizar la secuenciación del ARN, que nos dirá cómo cambian los perfiles de expresión génica durante la formación de organoides o en respuesta a la manipulación. Este modelo ha permitido que el campo de la próstata tenga un ensayo ex vivo reproducible para estudiar los aspectos fundamentales de la biología epitelial e identificar reguladores en el desarrollo y la diferenciación.
