Este protocolo demuestra un método mejorado para obtener células epiteliales dentales humanas. Es difícil identificar el pellet celular agregado durante los procedimientos. Tenga cuidado cuando manipule sobrenadante para prevenir la pérdida de poblaciones celulares.
Para comenzar, recolecte los folículos dentales durante la extracción quirúrgica de los terceros molares impactados. Comience los procedimientos de aislamiento celular o almacene los folículos dentales a cuatro grados Celsius en DPBS con 3% de penicilina-estreptomicina. Para lavar los folículos dentales, sostenga el folículo dental con pinzas y colóquelo en el tubo de lavado 1.
Agítelo suavemente de 10 a 15 veces. Sácalo y colócalo en el tubo 2. Una vez más, agítelo de 10 a 15 veces.
Finalmente, sáquelo y colóquelo en el tubo 3, luego agítelo. Después de lavar tres veces, coloque el folículo dental en un plato de cultivo de 60 milímetros. Picar el tejido con tijeras de tejido hasta que el folículo dental tenga una apariencia pulposa o blanda.
Use una pequeña sección lateral de la placa de cultivo para minimizar la pérdida de tejido. Mezcle un mililitro cada una de la solución de colagenasa tipo 1 y proteasa en un tubo cónico de 15 mililitros. Transfiera el tejido picado al tubo cónico de 15 mililitros, luego agítelo suavemente e incube durante una hora a 37 grados centígrados.
Agregue cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% al tubo. Agitarlo e incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Preparar medio de queratinocitos que contenga medio libre de suero de queratinocitos y suero bovino fetal al 10%.
Agregue tres mililitros de medio de queratinocitos en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Coloque un colador de 40 micrómetros encima de este tubo. A continuación, aspire el sobrenadante del tubo que contiene el tejido con una pipeta serológica de 10 mililitros y páselo a través del colador.
Transfiera la suspensión recogida a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifuga el tubo y retira el sobrenadante. Luego agregue tres mililitros de medio libre de suero de queratinocitos.
Centrifugar durante otros tres minutos y retirar el sobrenadante. Coloque la población unicelular en una placa de cultivo de 60 milímetros utilizando el medio libre de suero de queratinocitos. Mantener el plato de cultivo con un volumen final de cinco mililitros en una atmósfera humidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados.
Las células con morfología epitelial aparecieron dentro de los siete a 10 días posteriores al recubrimiento de poblaciones unicelulares. El número de células epiteliales en forma de adoquín varió de una a 10 en el momento de la emergencia y las células se expandieron en colonias con el tiempo. El paso más crucial es picar el folículo dental en pequeñas partículas.
Mejora la separación de células individuales del tejido folicular. Las células mesenquimales se pueden aislar del folículo dental humano. El entorno de cultivo que contiene suero selecciona las células mesenquimales e inhibe el crecimiento epitelial de las poblaciones de células individuales.
Este protocolo proporciona el método de obtención de las células epiteliales dentales humanas. Las células epiteliales derivadas del folículo dental se pueden utilizar para el estudio de las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales.
