Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Ciencia y Tecnología de MTC de la provincia de Zhejiang, China (2017ZA055; 2018ZA036), y el Proyecto de Ciencia y Tecnología de Zunyi, provincia de Guizhou, China (Zunyi City Kehe Support NS (2020) No. 18) a X. Xu. Los autores agradecen al Laboratorio de Biología Molecular de la Compañía de Tecnología Biomédica de Youjia (Hangzhou) por proporcionar capacitación en cultivos celulares.

Los tejidos mamarios normales frescos utilizados en este protocolo se recolectan de la cirugía alrededor de la lesión de mastitis lobulillar granulomatosa refractaria en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica China de Zhejiang de acuerdo con las pautas del Comité de Ética Médica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica China de Zhejiang (Protocolo No. ChiMCTR2100005281, Fecha: 2017-07-17).
1. Adquisición de tejido
<ol><li>Recoja tejidos mamarios frescos de muestras quirúrgicas tomadas de mujeres adultas en tubos estériles que contengan 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 3% de penicilina/estreptomicina (P/S). NOTA: Los tejidos mamarios deben manipularse de acuerdo con los siguientes detalles dentro de las 24 horas posteriores a la recolección de la cirugía.</li>
</ol>2. Pretratamiento de los tejidos
<ol><li>Retire el tejido adiposo del tejido mamario con dos pares de pinzas, asegurándose de que el tejido mamario restante tenga ~ 1 g de peso.</li>
	<li>Enjuagar el tejido mamario en una solución de etanol al 75% (5 mL) durante 5 s y luego lavar con 20 mL de solución de lavado (Tabla 1) durante 2 x 5 min.</li>
</ol>3. Digestión de los tejidos
<ol><li>Cortar el tejido mamario en fragmentos más pequeños, triturando el tejido con dos cuchillas quirúrgicas durante 15 min para obtener el tejido homogeneizado. Transfiera las piezas de tejido a un tubo centrífugo de 50 ml.</li>
	<li>Añadir 10 mL de 5,0 mg/mL de dispasa + 5,0 mg/mL de solución de colagenasa, 3 mL de tripsina al 0,25% y 7 mL de PBS a un total de 20 mL de solución de digestión en un tubo centrífugo de 50 mL que contiene los fragmentos de tejido mamario. Colocar el tubo en un baño de agua a 37 °C e incubar durante 1,5 h; Agite el tubo cada 20 min.</li>
	<li>Detenga el proceso de digestión inyectando 20 mL de la solución neutralizante. Mezcle el contenido pipeteando ~ 15x.</li>
	<li>Filtre la mezcla a través de un filtro de malla de 100 μm. Centrifugar a 156 × g durante 5 min.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y repetir la incubación del pellet con 20 mL de solución neutralizante. Mezclar el contenido pipeteando 15x y centrifugar a 156 × g durante 5 min.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante con cuidado y resuspender el pellet celular con 10 mL de medio de cultivo inicial. Coloque la suspensión celular en una placa de cultivo celular de 100 mm.</li>
	<li>Cultivar las células en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Reemplace el medio de cultivo original con medio de células epiteliales frescas cada tres días. Revise las celdas y actualice el medio cada 2 días.</li>
</ol>4. Paso de celdas
<ol><li>Retire la placa de 100 mm de la incubadora cuando las células alcancen el 80%-90% de confluencia, deseche el medio usado y enjuague la placa 2 veces con 2 ml de PBS. Retire el PBS y luego agregue 2 ml de tripsina al 0,05% en cada plato de 100 mm. NOTA: Gire el plato para asegurarse de que la solución de tripsina tenga suficiente contacto con el fondo del plato.</li>
	<li>Coloque el plato de 100 mm en una incubadora a 37 °C durante ~7 min para el proceso de digestión.</li>
	<li>Examine las células con un microscopio utilizando un objetivo de 40x para asegurarse de que la mayoría de las células se hayan disociado del fondo de la placa.</li>
	<li>Detenga el proceso de digestión agregando 8 mL de solución neutralizante y transfiera las células a un tubo de 15 mL. Mezcle las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces. Centrifugar las células a 156 × g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con cuidado, vuelva a suspender las células con 10 ml de medio celular epitelial y cuente el número de células.</li>
	<li>Añadir 1 × 106 células en 10 mL de medio de células epiteliales en una placa de 100 mm.</li>
	<li>Refresque el medio celular epitelial y observe las células cada 2 días.</li>
</ol>5. Criopreservación celular
<ol><li>Repita los pasos 4.1-4.4.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender las células en 2 ml de solución de criopreservación celular.</li>
	<li>Transfiera 1 mL de la solución de criopreservación que contiene las células a cada vial criogénico.</li>
	<li>Registre los nombres de las células criopreservadas, los números de paso y las fechas.</li>
	<li>Coloque los viales en un recipiente de congelación de velocidad controlada a -80 °C durante la noche.</li>
	<li>Retire los viales criogénicos del congelador a -80 °C y transfiéralos rápidamente a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>

Protocolo para el aislamiento de células epiteliales mamarias de tejido humano

<ol>
	<li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer-epidemiology,+classification,+pathogenesis+and+treatment+(review+of+literature).">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).</li><li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cells:+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia.">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li><li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women's+breast+cancer+tumors.">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li><li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+rat+mammary+gland:+Isolation,+characterization,+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts.">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818 (2020).</li><li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selective+secondary+tissue+attachment&amp;#34;+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells.">A &amp;#34;selective secondary tissue attachment&amp;#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972 (2022).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project.">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012 (2021).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds.">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li><li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells.">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784 (2018).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632.">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978 (2021).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture.">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li><li>B&#246;cker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+breast.">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li><li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland.">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li><li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering.">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li><li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media.">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li><li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types.">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li><li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk.">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li><li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing.">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>&#346;cie&#380;y&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review.">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase.">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831 (2017).</li></ol>

Los autores declaran que no existen conflictos de interés con respecto a la publicación de este artículo.

Las HMEC son vitales para preservar la integridad anatómica y funcional del tejido mamario y son útiles en investigaciones científicas, implementaciones clínicas y dominios asociados15. Las células epiteliales primarias son un tipo de células especializadas que tienen pasajes limitados y vidas más cortas. Sin embargo, el crecimiento de las HMEC se ha visto obstaculizado por limitaciones técnicas, que en consecuencia han obstaculizado los avances en la investigación sobre el cáncer de mam...

El cáncer de mama es el principal tipo de cáncer diagnosticado en mujeres a nivel mundial y es la principal causa de muerte por cáncer1. La patogenia del cáncer de mama es compleja e involucra múltiples factores como la genética, el medio ambiente y el estilo de vida. Las HMEC, células activas productoras de leche, son uno de los componentes más importantes del tejido mamario y probablemente son las células originales involucradas en la carcinogénesis del cáncer de mama. Por lo tanto, las HMEC han recibido la mayor atención de los investigadores para el estudio del cáncer de mama2. Además, las células primarias tienen la capacidad de proporcionar una caracterización biológicamente relevante de procesos celulares complejos debido a que conservan estabilidad genética, morfología normal y un conjunto más completo de funciones celulares básicas que no se pueden lograr con líneas celulares inmortalizadas3. Por lo tanto, el aislamiento y cultivo de las HMEC primarias es un paso esencial para el estudio de la mayoría de las enfermedades relacionadas con la mama, como el cáncer de mama y las enfermedades inflamatorias mamarias.
En la actualidad, se ha establecido un sistema estable y reproducible para el aislamiento, cultivo e identificación de células epiteliales mamarias de ratas, vacas, cerdos y cabras 4,5,6,7. Sin embargo, el aislamiento y el cultivo de HMEC primarios son un desafío debido al microambiente complejo y al bajo rendimiento de las células. Durante décadas, los científicos han estado buscando el método más eficaz para aislar y cultivar HMEC, aunque hace casi 20 años se estableció un sistema de cultivo para HMEC. Por ejemplo, Hammond et al. desarrollaron un medio de cultivo sin suero en el que las HMECs crecieron eficientemente8. Recientemente, Zubeldia-Plazaola et al. probaron cuatro métodos de aislamiento diferentes utilizando procedimientos de digestión enzimática rápida/lenta combinados con filtración secuencial o pasos de centrifugación diferencial para obtener HMECs9. Descubrieron que el método de digestión lenta, junto con la centrifugación diferencial, es el método más eficiente para aislar las HMEC del tejido mamario fresco. Sin embargo, ese método de aislamiento requiere grandes trozos de tejido (40-75 g) y utiliza mayores cantidades de enzimas digestivas. Su procedimiento es complicado (al menos tres centrifugaciones diferentes para obtener diferentes fracciones celulares), además de lento. Por lo tanto, todavía se necesita un método simple y rápido para obtener de manera eficiente poblaciones de HMEC a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario para aplicaciones clínicas y de investigación9.
Nuestros estudios previos demostraron que la adición del inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 en el medio de cultivo inicial puede simplificar el proceso de aislamiento de células epidérmicas de piel humana10, que también se ha utilizado con éxito para el aislamiento de células epiteliales gingivales11. Además, investigaciones previas realizadas por el grupo de Zubeldia-Plazaola y el grupo de Jin han indicado que Y-27632 tiene la capacidad de estimular el crecimiento in vitro rápido e ilimitado de células epiteliales primarias derivadas del tejido mamario 9,12. El presente estudio tuvo como objetivo probar si el uso de Y-27632 simplificaría el aislamiento y el cultivo de HMEC y establecimos con éxito un método simple y fácil de realizar para aislar HMEC de pequeños trozos (1 g) de tejido mamario.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Basalmedia</td>
			<td>K431010</td>
			<td>For HMECs&#160; dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge Tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>081722CK01</td>
			<td>For cell digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m mesh filter</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>For HMECs filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>solarbio</td>
			<td>P1110-100ml</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>For cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404HN133048</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>42820906</td>
			<td>For cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SKU:SCR103</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>CAS:42613-33-2</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122622</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2556132P</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Tecono</td>
			<td>20201033</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti CK7</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab68459</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti GATA3</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab199428</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>IY0040</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary human mammary epithelial cells

La glándula mamaria es una estructura fundamental de la mama y desempeña un papel esencial en la reproducción. Las células epiteliales mamarias humanas (HMEC), que son las células de origen del cáncer de mama y otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la mama, han atraído una atención considerable. Sin embargo, el aislamiento y cultivo de HMECs primarias in vitro con fines de investigación ha sido un desafío debido a su naturaleza altamente diferenciada y queratinizada y su corta vida útil. Por lo tanto, el desarrollo de un método simple y eficiente para aislar y cultivar HMEC es de gran valor científico para el estudio de la biología mamaria y las enfermedades relacionadas con la mama. En este estudio, aislamos con éxito HMECs primarias de pequeñas cantidades de tejido mamario por digestión con una mezcla de enzimas combinada con un cultivo inicial en suero fetal bovino-DMEM al 5% que contenía el inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632, seguido de la expansión del cultivo en medio de queratinocitos libre de suero. Este enfoque promueve selectivamente el crecimiento de las células epiteliales, lo que resulta en un rendimiento celular optimizado. La simplicidad y conveniencia de este método lo hacen adecuado tanto para la investigación de laboratorio como para la clínica, que debería proporcionar información valiosa sobre estas importantes áreas de estudio.

Breast cancer is the primary type of cancer diagnosed in women globally and is the primary cause of death from cancer1. The pathogenesis of breast cancer is complex, involving multiple factors such as genetics, environment, and lifestyle. HMECs, active milk-producing cells, are one of the most important components of mammary tissue and likely are the original cells involved in breast cancer carcinogenesis. Therefore, HMECs have received the most attention from researchers for the study of breast cancer2. Furthermore, primary cells have the ability to provide a biologically relevant characterization of complex cellular processes due to their retention of genetic stability, normal morphology, and a more complete set of basic cellular functions that cannot be achieved with immortalized cell lines3. Hence, the isolation and culture of primary HMECs is an essential step for the study of most breast-related diseases such as breast cancer and breast inflammatory diseases.
At present, a stable and reproducible system for the isolation, culture, and identification of mammary epithelial cells from rats, cows, pigs, and goats has been established4,5,6,7. However, the isolation and culture of primary HMECs are challenging due to the complex microenvironment and the low yield of cells. For decades, scientists have been searching for the most effective method to isolate and cultivate HMECs although a culture system for HMECs was established nearly 20 years ago. For example, Hammond et al. developed a serum-free culture medium in which HMECs grew efficiently8. Recently, Zubeldia-Plazaola et al. tested four different isolation methods using fast/slow enzyme digestion procedures combined with sequential filtration or differential centrifugation steps to obtain HMECs9. They found that the slow digestion method together with differential centrifugation is the most efficient method to isolate HMECs from fresh breast tissue. However, that isolation method requires large pieces of tissue (40-75 g) and uses larger amounts of digestion enzymes. Their procedure is complicated (at least three different centrifugations to obtain different cell fractions), as well as time-consuming. Therefore, a simple and quick method is still needed to efficiently obtain populations of HMECs from small amounts of mammary tissue for research and clinical applications9.
Our previous studies showed that adding the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 into the initial culture medium can simplify the process of isolating human skin epidermal cells10, which has also been successfully used for the isolation of gingival epithelial cells11. Additionally, earlier research conducted by Zubeldia-Plazaola&#39;s group and Jin&#39;s group has indicated that Y-27632 has the ability to stimulate quick and unlimited in vitro growth of primary epithelial cells derived from mammary tissue9,12. The present study aimed to test whether using Y-27632 would simplify the isolation and culture of HMECs and we successfully established a simple and easily performed method to isolate HMECs from small pieces (1 g) of mammary tissue.

Autor destacado: Integración de la medicina oriental y occidental para el tratamiento de la mastitis granulomatosa

Aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias

Our research focus on elucidating the treatment avenues for refractory granulomatous mastitis. Leveraging an integrative approach that combines traditional Chinese and Western medicinal methodologies simultaneously will expose the complex pathogenic mechanisms driving the disease and its complications, with a focus to endeavor to alleviate these issues and improve patient prognostication. Our research reports an easier, time-saving, and the economical protocol for efficiently isolating and growing primary human mammary epithelial cells, or HMECs, from a small amount of mammary tissue.This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs for lab and clinical applications. Building upon this study, we aim to develop a granulomatous mastitis mammary epithelial cell model to deepen our understanding of etiology and validated treatment strategies.

En la figura 1 se muestra un esquema del procedimiento. El protocolo implica el uso de una combinación de enzimas, a saber, dispasa, colagenasa y tripsina. Esta combinación se utiliza con el propósito de separar la lámina epitelial de la capa de fibroblastos debajo de ella y, posteriormente, utilizar tripsina para disociar las células epiteliales mamarias en una suspensión. Además, se promovió eficazmente el crecimiento de las células epiteliales mediante la adición de Y-27632 al m...

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El presente estudio informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias (HMEC) a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario. Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas.

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

Nuestra investigación se centra en dilucidar las vías de tratamiento de la mastitis granulomatosa refractaria. Aprovechar un enfoque integrador que combine las metodologías medicinales tradicionales chinas y occidentales simultáneamente expondrá los complejos mecanismos patogénicos que impulsan la enfermedad y sus complicaciones, con el objetivo de tratar de aliviar estos problemas y mejorar el pronóstico de los pacientes. Nuestra investigación informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias, o HMEC, a partir de una pequeña cantidad de tejido mamario.Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios para aplicaciones clínicas y de laboratorio. Sobre la base de este estudio, nuestro objetivo es desarrollar un modelo de células epiteliales mamarias de mastitis granulomatosa para profundizar nuestra comprensión de la etiología y las estrategias de tratamiento validadas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

565 vistas.  The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University. Nuestra investigación se centra en dilucidar las vías de tratamiento de la mastitis granulomatosa refractaria. Aprovechar un enfoque integrador que combine las metodologías medicinales tradicionales chinas y occidentales simultáneamente expondrá los complejos mecanismos patogénicos que impulsan la enfermedad y sus complicaciones, con el objetivo de tratar de aliviar estos problemas y mejorar el pronóstico de los pacientes. Nuestra investigación informa de un protocolo más fácil, eco...

Video: Autor destacado: Integración de la medicina oriental y occidental para el tratamiento de la mastitis granulomatosa

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

Investigación

Biología

Digestion of Mammary Tissue for Isolating Human Mammary Epithelial Cells

Begin by dissociating the tissue. Use two pairs of forceps to remove the adipose tissue from the mammary tissue. Ensure that the remaining mammary tissue weighs approximately one gram.Rinse the mammary tissue in five milliliters of 75%ethanol solution for five seconds. Then, wash with 20 milliliters of washing solution two times for five minutes each. Then, use two surgical blades to slice the mammary tissue into smaller fragments.Continuously for 15 minutes to obtain a tissue homogenate, transfer the shredded tissue to a 50 milliliter centrifuge tube. Add 10 milliliters of dispase and collagenase solution, three milliliters of 0.25%trypsin, and seven milliliters of PBS for a total of 20 milliliters of digestion solution. Place the tube in a water bath at 37 degrees Celsius and incubate for 1 1/2 hours, shaking the tube every 20 minutes.To stop the digestion process, add 20 milliliters of neutralizing solution. Then, pipette the contents approximately 15 times to ensure thorough mixing. Filter the mixture through a 100 micron mesh filter.After that, centrifuge at 156G for five minutes. Then, remove the supernatant. Repeat incubation of the pellet with 20 milliliters of neutralizing solution, then mix by pipetting.Centrifuge again for five minutes. Carefully remove the supernatant and resuspend the cell pellet with 10 milliliters of initial culture medium. Plate the cell suspension in a 100 millimeter cell culture dish.Cultivate the cells in a 5%carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. Replace the original culture medium with fresh epithelial cell medium every third day. Check the cells and refresh the medium every two days.Using this protocol, human mammary epithelial cells were isolated from mammary tissue. Post isolation analysis showed that cells treated with ROCK inhibitor Y-27632 exhibited pronounced growth compared to the control group. CCK-8 assay revealed that cells in the medium containing Y-27632 proliferated at a significantly higher rate than those in the control medium.Immunofluorescence assays confirmed that the majority of cells expressed mammary epithelial cell markers, CK7 and GATA3, with negligible presence of other cell types in subsequent passages. Further, qRT-PCR studies showed consistent expression levels of CK7 and GATA3 over several passages indicating consistent phenotype or differentiation capacity.