La proliferación es una medida importante de la función celular. Este protocolo permite a los investigadores desarrollar un ensayo de proliferación sensible en sus laboratorios sin el alto costo de los kits disponibles comercialmente. La principal ventaja de esta técnica es que evita el tratamiento duro de las células y/o el uso de radiactividad.
Demostrando esta técnica estará Vicky Wong, la gerente de mi laboratorio. Para ensayar la proliferación, elimine las células musculares lisas vasculares de un matraz con medios de células musculares lisas en un suero bovino 2%fetal y una placa a 20.000 células por mililitro en DMEM en una placa de 96 pozos. Crecer las células a 37 grados Celsius durante la noche.
Añadir 30 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas a tres a seis pozos como un control positivo para estimular la proliferación. A continuación, agregue PBS al mismo número de pozos que un control negativo. Incubar durante 72 horas.
Diluir el caldo de EdU de cinco mililitros previamente preparado a un milimolar y añadir dos microlitros a cada pozo durante las últimas 24 horas del período de cultivo de 72 horas. Mantenga un conjunto de réplicas sin EdU para determinar la fluorescencia y la luminiscencia de fondo. Veinticuatro horas más tarde, fijar las células mediante la eliminación de medios, a continuación, añadir 150 microlitros por pozo de 4%paraformaldehído e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
Retire el paraformaldehído y agregue 150 microlitros de 1%TX-100 en agua por pozo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar tres veces con PBS para quitar el TX-100. Para detectar EdU incorporado usando fluorescencia, hacer 10 mililitros de solución de etiquetado por placa de 96 pozos justo antes de su uso mediante la adición de reactivos de soluciones de stock en el orden correcto: 20 microlitros THPTA, 20 microlitros sulfato de cobre, cinco microlitros fluoresceína picol-azida, y 100 microlitros asbato de sodio en PBS para un volumen total de 10 mililitros.
El paso más crítico es hacer que la solución de etiquetado sea justo antes de su uso. Retire el PBS de los pozos, agregue 150 microlitros de solución de etiquetado a cada pozo e incubar 30 minutos a 37 grados centígrados. Para detectar todos los núcleos, agregue DAPI a cada pozo e imagen en un microscopio fluorescente o lector de placas de imagen.
Para evitar el recuento manual y cuando no hay disponible un lector de placas de imagen, este protocolo se puede modificar a una lectura de luminiscencia utilizando azide HRP y un sustrato ELISA. Para detectar EdU utilizando luminiscencia, primero prepare la solución salina tris-buffered con 0.1%polisorbato 20. A continuación, agregue 150 microlitros de tampón de bloqueo a cada pozo e incubar durante 90 minutos a temperatura ambiente.
Después de retirar el tampón de bloqueo, lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS. Para detectar EdU incorporado, primero prepare 10 mililitros de solución de etiquetado por placa de 96 pozos añadiendo reactivos de las soluciones de stock en el orden correcto. Primero, 20 microlitros THPTA, luego 20 microlitros sulfato de cobre, cinco microlitros biotina picol-azida, 100 microlitros de ascorbato de sodio en PBS para un volumen total de 10 mililitros.
Lave los pozos cinco veces tres minutos con 200 microlitros de TBST con agitación. Apagar peróxidasas endógenas con 150 microlitros de 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar el peróxido de hidrógeno, lave cinco veces tres minutos con 200 microlitros de TBST con agitación.
Añadir 50 microlitros de peroxidasa diluida de estreptavidina-caballo en TBST a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Lavar cinco veces tres minutos con 200 microlitros de TBST con agitación. Añadir 50 microlitros de sustrato ELISA quimiuminoscente a cada pozo y leer inmediatamente en un lector de placas capaz de detectar luminiscencia.
Aunque los núcleos fluorescentes pueden ser detectados por un lector de placas de fluorescencia estándar, utilizando el protocolo de luminiscencia, el escaneo fluorescente se convierte en una lectura de líquido homogénea detectada con peroxidasa de rábano de caballo de estreptavidina y un sustrato ELISA estándar. La ventaja de este método en comparación con una lectura fluorescente es una lectura más homogénea y la placa se puede leer en segundos como se ve aquí cuando se midió la proliferación de VSMC en respuesta a PDGF. La desventaja es que el fondo es más alto que con la fluorescencia, por lo tanto los controles negativos tienden a ser más altos.
En un intento de disminuir la variabilidad, los resultados se normalizaron al recuento de celdas inicial. Sin embargo, en un conjunto separado de experimentos, se demostró que este método no es lo suficientemente sensible como para detectar pequeñas diferencias en los números de celda. La forma más eficiente y precisa de contar las células positivas y totales de EdU es mediante el uso de un lector de placas de imágenes.
Si este tipo de lector de placas no está disponible, el recuento manual también producirá resultados precisos. Al comparar estos dos métodos, el recuento manual positivo de EdU era idéntico al recuento automatizado, al igual que los recuentos totales no estimulados. La ventaja de estos dos métodos es la visibilidad de las células a contar, una mayor precisión y que se pueden ver y evitar manchas inespecíficas de escombros.
La principal desventaja con el método de conteo manual es el tiempo. Recuerde hacer la solución de etiquetado fresca justo antes de su uso y añadir los ingredientes en el orden proporcionado en el protocolo escrito. Si la intensidad de la tinción es tenue, intente ajustar la relación quelante a cobre.
Recuerde que el paraformaldehído es tóxico. Se debe utilizar en una campana de humos mientras usa guantes. El procedimiento en sí no es difícil, pero puede ser necesario optimizar mediante el ajuste de las relaciones de quelante a cobre en la solución de etiquetado.
Además, los tiempos de incubación y la duración del tratamiento con EdU se pueden ajustar dependiendo del tipo de célula y de la pregunta específica que se haga. Esta técnica es compatible con la superficie celular y la tinción intracelular de modo que se puedan determinar las características de las células divisorias y no divisorias. Aunque comúnmente se utiliza para medir la proliferación, la química de clics también se puede utilizar para el etiquetado metabólico de ARN, proteínas, ácidos grasos y carbohidratos.
Si el objetivo metabólico de interés está en la superficie celular, las células vivas se pueden etiquetar.
