Este trabajo fue apoyado por el NIH HL109478 (KNF). Los autores reconocen y agradecen a Gina Kim y Joann Taylor por su ayuda en el aislamiento y el mantenimiento de la PASMC en la cultura.

El animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad Northwestern aprobaron este protocolo. 1. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Day One <ol><li> Preparar las completas medio M199 - M199 Mix 400 ml con 100 ml (concentración final = 20%) FBS inactivado por calor y 5 ml (concentración final = 1%) Penicilina / Estreptomicina. </li><li> Preparar los Libres en Suero M199 Media - Mezcla 500 ml M199 con 5 ml (concentración final = 1%), penicilina / estreptomicina. </li><li> Preparar la agarosa PA - Mix 0,05 g de agarosa, más 0,05 g de partículas de hierro en 10 ml estériles, medio M199 libre de suero. </li><li> Preparar el pulmón de agarosa - Mezclar 0,1 g de agarosa en 10 ml estériles, medio M199 libre de suero. </li><li> Preparar la colagenasa - colagenasa mezcla estériles, en medio M199 libre de suero a una concentración final de 80 U / ml y después se filtro estéril de esta mezcla. </li&gt; <li> Configurar todos los equipos antes de tiempo antes de la eutanasia con el ratón. </li><li> Set PA agarosa y pulmón agarosa a ebullición justo antes de la eutanasia con el ratón. </li><li> La eutanasia del ratón en el frasco con la sobredosis de anestésico isoflurano y tener cuidado de no permitir que el ratón cachorro a entrar en contacto con el isoflurano. Se obtiene el mejor rendimiento celular cuando las células se recogen inmediatamente después de la muerte con el fin de evitar la micro-coágulos que se forman en la circulación después de la muerte. </li><li> Retire el ratón de la jarra anestesia, asegure el ratón para el tablero de operación, y esterilizar el ratón, los instrumentos y los guantes con alcohol. </li><li> Cargar el bisturí con la cuchilla de incisión y el ratón desde el cuello hasta el abdomen inferior. </li><li> Abra el abdomen en el lado izquierdo del mouse, exponer el riñón, y cortar la arteria renal para permitir el ratón para Exsanguinate, evitando así los coágulos en los vasos sanguíneos pequeños de los pulmones. </li><li> Utilice unas tijeras para cortar a lo largo del lado del botón izquierdo delel esternón para abrir el tórax. </li><li> Utilizar con cuidado bisturí para cortar el diafragma en ambos lados y abra completamente la cavidad torácica. El uso de fórceps o alfileres para sujetar la cavidad torácica abierta. </li><li> Pegue la RV con una aguja de 27 G ½ pulgadas dirigido a la Autoridad Palestina y la perfusión del VD / PA / pulmones de PBS estéril hasta que los pulmones se ven blancos (toda la sangre enrojeció de la circulación pulmonar). Esto tomará aproximadamente 3-5 ml de PBS en función del tamaño del ratón. Es importante para eliminar primero para evitar la formación de coágulos en los pequeños vasos pulmonares. </li><li> Utilizar con cuidado disección roma para exponer la tráquea y el hilo de sutura debajo de uno. </li><li> Poner las pinzas más pequeñas debajo de la tráquea para apoyo y colocar el G angiocatéter 24 en la tráquea. Coloque el angiocatéter como la colocación de una vía intravenosa. </li><li> Asegure el angiocatéter en la tráquea con la sutura enhebrada en el paso 1.16. </li><li> Tome hirviendo PA agarosa de agua hirviendo, e invierta para mezclar bien. Se enfría la agarosí a aproximadamente la temperatura corporal por agitación en hielo. La agarosa debe permanecer en la solución, pero no es tan caliente que puede dañar las células de la PA. </li><li> Pegue la RV con una aguja 27 G ½ pulgadas y la perfusión del VD / PA / PA pulmones de agarosa hasta que los pulmones se ven grises. Las partículas de hierro en la mezcla de agarosa harán los pulmones aparecen de color gris. Esto tomará aproximadamente 3-5 ml de agarosa PA en función del tamaño del ratón. También es importante para ir lentamente como la inyección demasiado rápido podría provocar que el hierro se filtre en las vías respiratorias. </li><li> Tome la agarosa pulmón de agua hirviendo y se invierta para mezclar bien. Luego enfriar la agarosa hasta aproximadamente la temperatura corporal por agitación en hielo. La agarosa tiene que permanecer en solución, pero no ser tan caliente que se va a dañar las células del pulmón. </li><li> Elaborar la agarosa pulmón y conectar la jeringa al angiocatéter 24 G en la tráquea. Infundir la agarosa a través de la tráquea para inflar completamente los pulmones. Los pulmones serán Easier para picar (consulte los pasos posteriores) si los pulmones están infladas apropiadamente. </li><li> Retire el bloque corazón-pulmón, y se sumergen en 25 ml de PBS frío para solidificar la agarosa (~ 5 min). Aproveche este tiempo para limpiar el área de la cirugía. </li><li> Para los ratones neonatales (P7-P21), el mejor rendimiento PASMC proviene de la combinación 2-3 crías en un lote de células. PASMC prefieren estar en contacto con otras células para la salud y el crecimiento celular óptimo. Si un ratón se utiliza por el aislamiento, a continuación, las células son muy escasos y no crecen bien. Cuando se combinan los animales, la cosecha y enfriar los bloques de corazón-pulmón juntos y luego pasar a picar una vez que todos los bloques de corazón-pulmón se han eliminado de los animales. </li><li> Mover a la campana de cultivo celular para la esterilidad a partir de este punto. </li><li> Coloque los pulmones refrigerados en la tapa de la placa de cultivo de 10 cm de tejido y retirar con cuidado el corazón, timo, tráquea, y cualquier tejido conectivo de los pulmones. </li><li> Mover los pulmones a la parte inferior de la placa de cultivo de 10 cm de tejidoy añadir aproximadamente 1 ml de helado de PBS estéril. </li><li> Picar los pulmones en trozos muy pequeños (1-2 mm) con 2 escalpelos. </li><li> Rompa la punta de una pipeta de 5 ml serológica estéril. Pipetear picada suspensión de pulmón en el tubo cónico estéril de 50 ml. El uso adicional de PBS estéril enfriada en hielo para lavar la placa para asegurarse de que todo el tejido del pulmón se mete en el tubo cónico de 50 ml. </li><li> Colocar el tubo cónico de 50 ml en el imán. Esperar a que el tejido que contiene hierro se mueva hacia el lado del tubo al lado del imán. Dependiendo de la relación de recipiente que contiene hierro en el tejido pulmonar, algunos de los vasos todavía pueden ser flotando en este punto. Aspirar el PBS lenta y cuidadosamente tratando de no aspirar tejido pulmonar flotante ya que no está claro si contiene vasos. </li><li> Lavar el sedimento de pulmón 3x con 5 ml de PBS estéril, de nuevo tratando de minimizar la cantidad de tejido pulmonar que se aspira. </li><li> Resuspender el precipitado de pulmón en 3 ml de colagenasa y se vierte en 60 mm de placa de cultivo tisular. No hagatratan de pipeta esto, los trozos de pulmón se adhieren al interior de la pipeta. </li><li> Utilice un 3 ml adicionales para enjuagar el tubo después de verter, y verter esta en 60 mm de plato de cultivo de tejidos también. </li><li> Lugar en 37 ° C incubadora de cultivo de tejido durante 1 hora. </li><li> Tejido pipeta + colagenasa lechada de arriba abajo con una G aguja roma 15 en una jeringa de 5 ml hasta que se interrumpen todas las piezas grandes de pulmón. El tejido + pasta colagenasa será despejado en este punto, sin trozos de tejido visibles. </li><li> Verter en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml y adjuntar al imán. </li><li> Lavar la placa de cultivo de tejido con aproximadamente 5 ml de medio M199 completos para asegurar que todo el tejido ha sido recogido, y verter esta en el tubo cónico. </li><li> Aspirar el sobrenadante de los medios de comunicación colagenasa +. Esta vez no será muy pocos flotadores, y un sedimento compacto que contiene hierro estará en el lado del tubo cónico próximo al imán. </li><li> Lavar con 5 ml med completaia 3x. Esto es necesario para inactivar la colagenasa. </li><li> Añadir 3 ml de medio completo, y se mezcla arriba y abajo varias veces para resuspender el precipitado que contiene hierro. </li><li> Verter el sedimento resuspendido en una placa de cultivo tisular de 35 mm. El uso de un microscopio, habrá pequeños fragmentos de vasijas que flotan alrededor con partículas de hierro contenidas en la luz del vaso. </li><li> Coloque la placa de cultivo de tejido (con la etiqueta placa de cero) en el incubador de cultivo de tejido durante la noche. Las primeras células que migran fuera en la placa cero son aproximadamente 50% fibroblastos y 50% PASMC, basado en la tinción para marcadores de músculo liso. Esta placa se llama cero plateado y en última instancia desecharse después de las etapas de enriquecimiento posteriores. </li></ol> 2. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Segundo día <ol><li> Verter el sobrenadante de los medios de comunicación de la placa de cero en un tubo cónico de 50 ml limpio. </li><li> Aspirar el sobrenadante de los medios de comunicación. Esta vez no habrá casi ninguna flotadores y un pacto de hierro containing pellet se forma en el lado del tubo cónico próximo al imán. </li><li> Lavar con 5 ml de medio completo 3x. </li><li> Añadir 3 ml de medio completo, y se mezcla arriba y abajo varias veces para resuspender el precipitado que contiene hierro. </li><li> Vierta la mezcla en una placa de cultivo tisular de 35 mm. El uso de un microscopio, pequeños fragmentos de vasijas que flotan alrededor con partículas de hierro contenidas en la luz del vaso se ven. Esta será una placa (Figura 1A). </li><li> Coloque la placa de cultivo tisular en el incubador de cultivo de tejido. </li></ol> 3. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Seis Días <ol><li> Verter el sobrenadante de los medios de comunicación de la placa de uno en un tubo cónico de 50 ml limpio. La repetición de este paso varias veces asegura que todas las células del músculo liso residentes en la pared del recipiente tienen la oportunidad de migrar fuera en una placa de cultivo celular. Hay un rendimiento decreciente con cada paso, es decir cada placa tendrá menos y menos células se adhieren. </li><li&gt; Placa de realimentación que tiene completos M199 medios de comunicación, y el lugar de nuevo en el cultivo de tejidos incubadora. </li><li> Aspirar el sobrenadante de los medios de comunicación. Esta vez no será casi no flotadores, y un sedimento compacto que contiene hierro se forma en el lado del tubo cónico próximo al imán. </li><li> Lavar con 5 ml de medio completo 3x. </li><li> Añadir 3 ml de medio completo, y se mezcla arriba y abajo varias veces para resuspender el precipitado que contiene hierro. </li><li> Vierta la mezcla en una placa de cultivo tisular de 35 mm. El uso de un microscopio, pequeños fragmentos de vasijas que flotan alrededor con partículas de hierro contenidas en la luz del vaso se ven. Esta será la placa dos. </li><li> Coloque la placa de cultivo tisular en el incubador de cultivo de tejido. </li></ol> 4. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Día Nueve <ol><li> Verter el sobrenadante de los medios de comunicación desde el cultivo en placa de plato de tisú de dos en un tubo cónico de 50 ml limpio. </li><li> Placa de realimentación con dos completos M199 medios de comunicación, y el lugar de nuevo en el cultivo de tejidosincubadora. </li><li> Aspirar el sobrenadante de los medios de comunicación. Esta vez no será casi no flotadores, y un sedimento compacto que contiene hierro se forma en el lado del tubo cónico próximo al imán. </li><li> Lavar con 5 ml de medio completo 3x. </li><li> Añadir 3 ml de medio completo y se mezcla arriba y abajo varias veces para resuspender el precipitado que contiene hierro. </li><li> Vierta la mezcla en una placa de cultivo tisular de 35 mm. El uso de un microscopio, pequeños fragmentos de vasijas que flotan alrededor con partículas de hierro contenidas en la luz del vaso se ven. Esta será la placa de tres. </li><li> Coloque la placa de cultivo tisular en el incubador de cultivo de tejido. </li></ol> 5. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Trece días <ol><li> Aspirar los medios de comunicación fuera de las placas 1-3. </li><li> Lave suavemente las células con una cálida, PBS estéril. </li><li> Añadir una película delgada de tripsina (~ 0,25-0,5 ml) tripsina a cada placa a trypsinize fuera de las células. Las células son muy adherente y tendrán que estar en tripsina en el tejido cultuvolver a la incubadora durante aproximadamente 10 minutos para levantar la placa. </li><li> Células de la cosecha de las planchas en 5 ml de medio completo en un tubo cónico de 50 ml unido al imán para sacar las partículas de hierro residual. </li><li> Lavar cada uno de las placas con un 0,5 ml adicionales de medio completo y añadir que los medios de comunicación para el tubo cónico de 50 ml. </li><li> Esta vez, toma el sobrenadante medios (no aspirar) y descartar la partícula de pellets de hierro. </li><li> Placa de las células en 5 ml de medio M199 completos en un plato de 60 mm a tienen células confluentes en unos pocos días. Alternativamente, la placa de las células en 10 ml M199 medio completo en una placa de 10 cm, y PASMC tardarán aproximadamente otros 1-2 semanas para alcanzar la confluencia. </li></ol> 6. Arteria Pulmonar Aislamiento de ratones recién nacidos - Día Catorce <ol><li> Cambie el soporte a nuevos completos M199 medios para eliminar la tripsina residual. Habrá una población delgada de PASMC en la placa de cultivo tisular (Figura 1B). </li></ol> 7. Cuidado de rutina <ol><li> Cambie el soporte a nuevos completos medio M199 aproximadamente 2 veces por semana. </li><li> Al dividir estas células, se requiere aproximadamente 10 min en la incubadora en una película de tripsina (0,25-0,5 ml) para las células para levantar la placa. Usando la película tripsina permite replating del PASMC sin dejar de dar vueltas a las células. Si se utiliza demasiado tripsina, a continuación, la PASMC debe ser centrifugado a girar a cabo la tripsina, o las células no readhere a la placa. A veces, después de dar vueltas al de las células, es difícil obtener la PASMC resuspendieron en medio M199 completos. </li><li> En sus observaciones, el PASMC aislado se comportan como células de músculo liso fiable para 4-5 pasajes, pero las células aisladas se mancha de células de músculo liso marcadores hasta el paso 7. Cuente el primer combinado de 60 mm o de 10 cm de placa con Trece día que pase 2 (planchas después de la primera exposición a tripsina). </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este manuscrito, se describe por primera vez el aislamiento de PASMC a partir de ratones en P7, P14, y P21. Con el fin de lograr esto, una suspensión de agarosa y 0,2 partículas de hierro mu M se infunden a través de la RV en la PA. Debido al pequeño tamaño de las partículas de hierro, que no pueden pasar a través del lecho capilar pulmonar y por lo tanto se deposita en la pequeña PA. Los pulmones se inflan, y se disocia. Los vasos que contienen hierro se sacan de la solución utilizando un imán. En última ...

La hipertensión pulmonar es normal durante la vida intrauterina desde la placenta sirve como el principal órgano de intercambio de gas y se hace circular sólo el 10% del gasto cardíaco a través del lecho vascular pulmonar. En el útero, las presiones pulmonares son similares a las presiones sistémicas debido a la elevación de la resistencia vascular pulmonar . Como gestación progresa, hay un rápido crecimiento de la pequeña PA dentro del pulmón, la preparación del feto para el dramático aumento en el flujo sanguíneo pulmonar que se produce en el nacimiento 1. Cuando la transición perinatal normal de falla en los bebés a corto plazo y de plazo completo, el resultado es la hipertensión pulmonar persistente del recién nacido (PPHN). HPP es un síndrome clínico causado por diferentes patologías de base. Sin embargo, todos estos lactantes comparten características fisiopatológicas comunes, tales como elevada resistencia vascular pulmonar, hipoxemia, y derivación de derecha a izquierda del flujo de sangre a través de conexiones fetales persistentes, tales como el conducto arterioso o paraAmén ovale. PPHN afecta a 2-6 por cada 1.000 nacidos vivos y transmite un riesgo 8-10% de la mortalidad y la morbilidad significativa a corto plazo y largo plazo 2. Además, los bebés prematuros de muy bajo peso pueden desarrollar hipertensión pulmonar como resultado de su enfermedad pulmonar subyacente. La enfermedad pulmonar subyacente más común de los bebés prematuros es la displasia broncopulmonar (DBP). Mientras que el riesgo general de BPD se correlaciona con la edad gestacional y el peso al nacer, no está claro por qué un subconjunto de estos niños desarrollan hipertensión pulmonar importante y cómo tratar adecuadamente a estos niños. Los malos resultados, incluyendo estancias hospitalarias prolongadas y aumento de la mortalidad, son comunes 3-6. Históricamente, PASMC fetal ovina o PASMC fetal porcino procedente de animales sanos se han utilizado para estudiar las vías de señalización implicadas en la transición vascular pulmonar normal después del nacimiento. Estos son típicamente aislados de resistencia PA de quinta generaciónn ovina o porcina feto que se entrega y sacrificados antes de cualquier respiración espontánea 7-9. Además, algunos investigadores han aislado y utilizado PASMC desde un poco más viejo y con respiración espontánea corderos y lechones a los 3 días, 2 semanas y 4 semanas 10-12. Más recientemente, algunos grupos han aislado y utilizado con éxito PASMC aislado de corderos con hipertensión pulmonar persistente para examinar las alteraciones en las vías de señalización en el estado de la enfermedad 13-17. Estas células han demostrado ser una herramienta valiosa para estudiar las vías de señalización que son cruciales tanto en la vasculatura pulmonar normal y enfermo a corto plazo y de plazo. Sin embargo, no se dan una idea de las vías de señalización afectadas en los bebés prematuros con hipertensión pulmonar. Tampoco permiten que las posibilidades de manipulación genética visto en los modelos de ratón de la enfermedad. Modelos de rata y el ratón han sido utilizados para modelar BPD y más recientemente se están utilizando para modelar hy pulmonarpertensión resultante de BPD 18-22. Ratas neonatales son muy atractivos para trabajar con debido a su mayor tamaño, sino que también sufren de falta de potencial para la modificación genética. Los animales genéticamente modificados se han utilizado ampliamente para investigar los efectos de los objetivos específicos de genes en la fisiología animal entero en ratones recién nacidos, pero hasta la fecha nadie ha aislado previamente con éxito PASMC de estos pequeños ratones. Al aislar PASMC, mayor información se puede obtener acerca de cómo las vías cambian en respuesta a los estímulos ambientales y / o la modificación genética específicamente en el músculo liso de la arteria pulmonar. Además, en vivo PASMC se pueden obtener imágenes en tiempo real para examinar los cambios rápidos en las moléculas de señalización clave, tales como el calcio y las especies reactivas de oxígeno 23-25. Recientemente hemos descrito el aislamiento con éxito de PASMC a partir de ratones adultos usando una variación de la técnica de Marshall et al. 26 utilizado para aislar rata PASMC 23,25,26. Ahora hemos adaptado unND extendió esta técnica para pequeños ratones 7-21 días de edad (P7, P14, y P21). La principal limitación de esta nueva técnica de aislamiento PASMC es que requiere varios ratones para generar suficientes células para los experimentos y que las células crecen muy lentamente, lo que es característico de las células musculares lisas primarias. A pesar de estas limitaciones, creemos que esta técnica para aislar neonatal PASMC ratón permitirá la mayor investigación sobre las vías de señalización clave que participan en el desarrollo de la hipertensión pulmonar y representa un avance significativo en este campo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard Parker surgical blade handle</td>
			<td>BD</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel surgical blades #10 (sterile)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657 and 306646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter (24 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoject blunt cannula (15 G)</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>SWD202314Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9782896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal magnet particle collector</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-01D</td>
			<td>This is a critical tool for the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353001, 353004, and 353003</td>
			<td>Any brand of tissue culture plates will be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors (4 &#189; inch stainless steel)</td>
			<td>American Diagnostic Corporation</td>
			<td>3424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (4 inch stainless steel)</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>L5-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TX16777-164NWU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone/Thermo Scientific</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>Heat inactivate at 55 &#176;C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron particles (iron (II, III) oxide powder)</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>#31,006-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (made to 80 U/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butlet Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-U</td>
			<td>Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-desmin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8281</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle myosin</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-562</td>
			<td>Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-red anti-rabbit secondary</td>
			<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
			<td>R-6394</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE300</td>
			<td>Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-AK800-0001</td>
			<td>This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sildenafil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ-0003</td>
			<td>A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice

La hipertensión pulmonar es una causa importante de morbilidad y mortalidad en recién nacidos. Históricamente, ha habido estudio significativo de las vías de señalización implicadas en la contracción del músculo liso vascular en PASMC de oveja fetal. Mientras ovejas crea un excelente modelo de hipertensión pulmonar plazo, que son muy caros y carecen de la ventaja de la manipulación genética que se encuentra en ratones. Por el contrario, la incapacidad de aislar PASMC de los ratones era una limitación significativa de ese sistema. Aquí hemos descrito el aislamiento de cultivos primarios de ratón PASMC desde P7, P14, y P21 ratones usando una variación de la técnica descrita anteriormente de Marshall et al. 26 que se utilizó anteriormente para aislar PASMC rata. Estos PASMC murino representan una nueva herramienta para el estudio de las vías de señalización en el período neonatal. Brevemente, una suspensión de 0,5% (w / v) de agarosa + 0,5% de partículas de hierro en medio M199 se infunden en el lecho vascular pulmonar a través del ventrículo derecho (VD). Lapartículas de hierro son 0,2 m de diámetro y no pueden pasar a través del lecho capilar pulmonar. Por lo tanto, las logias de hierro en las pequeñas arterias pulmonares (PA). Los pulmones se inflan con agarosa, y se disocia. Los vasos que contienen hierro se tiran hacia abajo con un imán. Después de la colagenasa (80 U / ml) el tratamiento y aún más la disociación, los vasos se colocan en un plato de cultivo de tejidos en medio M199 que contienen 20% de suero bovino fetal (FBS), y antibióticos (medio M199 completos) para permitir la migración de células en la placa de cultivo . Esta placa inicial de las células es una mezcla 50-50 de fibroblastos y PASMC. Por lo tanto, el procedimiento de extracción hacia abajo se repite varias veces para lograr una población PASMC más pura y eliminar todo el hierro residual. Identidad de la célula del músculo liso se confirmó mediante inmunotinción para la miosina del músculo liso y desmina.

Durante y después del aislamiento, PASMC se examinan tanto por microscopía de luz y por inmunotinción para marcadores de células musculares lisas. Mediante microscopía de luz temprano en el protocolo, PASMC se ven en la migración de la placa de cultivo de tejido de la pequeña de hierro que contiene vasos (Figura 1A). Después de agrupar las placas del uno al tres con Trece días, entonces las partículas de hierro ya no se ven como los han sacado en el paso final pooling. En su lugar, una poblaci...

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Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Hemos desarrollado una técnica novedosa y reproducibles para aislar los cultivos primarios de células musculares lisas de las arterias pulmonares (PASMC) a partir de ratones tan jóvenes como de P7, permitiendo de ese modo un mejor estudio de las vías de señalización implicadas en la contracción de las células del músculo liso neonatal y relajación.

El aislamiento de la arteria pulmonar células musculares lisas de los ratones recién nacidos

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.2K vistas.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Hemos desarrollado una técnica novedosa y reproducibles para aislar los cultivos primarios de células musculares lisas de las arterias pulmonares (PASMC) a partir de ratones tan jóvenes como de P7, permitiendo de ese modo un mejor estudio de las vías de señalización implicadas en la contracción de las células del músculo liso neonatal y relajación.

Video: Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focal Ca 2 + Detección de transitorios en el músculo liso

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Investigación

Biología

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

El aislamiento de los Derechos Humanos de la arteria umbilical células musculares lisas (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Medición de la proliferación de células musculares lisas vasculares mediante la química de clics

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...