Name: isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01HL056046 a PAL y K99HL116769 a AJT), y el Instituto de Investigación del Hospital Nacional de Niños (para PAL y AJT).

Declaración de Ética: Este estudio se realizó de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud, el cual fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión en el Hospital Nacional de Niños. 1. Preparación / Configurar Nota: Esta técnica de aislamiento requiere dos serpentines de calefacción Langendorff de lado a lado posicionado en un soporte de anillo, y conectado en paralelo a un baño de agua circulante. <ol><li> A su vez en baño de agua circulante y ajustar la temperatura para alcanzar una temperatura final de 33-34 ° C en la punta de la cánula de Langendorff (el baño de agua utilizado en esta configuración se establece en 40 ° C debido a una pérdida de 6-7 ° C de la temperatura a través de los tubos). Encender las bombas de perfusión y establecer la velocidad de perfusión de 0,5 ml / min. <ol><li> Limpiar ambos de los serpentines de calentamiento con camisa de agua, la tubería adjunta y 25 de cánula de calibre lavando cada una con 50 ml de 70% de etanol, seguidos por 100 ml de agua ultrapura tratada en autoclave. </li><li> Limpiar los serpentines de calefacciónempujando el aire con una jeringa y se lava con 10 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin rojo de fenol. Deja HBSS en los serpentines de calefacción y tubos. </li><li> Adjuntar un 10 ml jeringa luer-lock estéril llena de temperatura ambiente HBSS sin rojo de fenol al tubo. Asegúrese de que no queden burbujas de aire atrapadas dentro de las bobinas de tubos de calefacción y al colocar la jeringa llena de HBSS ya que esto podría causar una embolia de aire durante la digestión para impactar negativamente en el aislamiento CMLV. </li></ol></li><li> Retire la cánula de calibre 25 de los serpentines de calefacción y el lugar en otra jeringa de 10 ml estéril lleno de HBSS enfriado con hielo sin rojo fenol. Tenga esto en hielo hasta que esté listo para su uso. Repita este procedimiento para la otra cánula. </li><li> Preparar solución enzimática La digestión. <ol><li> Pesar colagenasa tipo 2 de acuerdo con el número de lote específico para 75 ml de solución de digestión para lograr una concentración final de 300 unidades / ml. </li><li> Disolver la colagenasa en 75 ml de HBSS con rojo de fenol. A continuación, añadir 1,5 ml de 00,1 mg / ml de inhibidor de tripsina de soja y 75 l de 1 M CaCl 2 a la mezcla. </li></ol></li><li> Si se utiliza la solución de digestión de inmediato, deje que se caliente a 37 ° C. Si no es así, lo coloca a 4 ° C durante un máximo de 6 horas. Esta solución se debe hacer todos los días frescos. </li><li> Prepare los medios de solución de parada / chapado. <ol><li> Agregar 100 ml de FBS inactivado por calor, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de aminoácidos no esenciales, 5 ml de HEPES, y 1 ml de primocin a 500 ml de alta glucosa (4,5 g / L) DMEM. se recomienda la esterilización del filtro. </li><li> Alícuota de 6 ml de la solución de parada en cada uno de los doce tubos de 15 ml cónicos, numeradas de A1 a A6 y B1-B6 y a 4 ° C. Alícuota de 50 ml de solución de paro en un cónica 50 ml y colocar en 37 ° C incubadora. Nota: Este paso también se puede preparar el día antes del aislamiento si es necesario. Esta solución de parada se utiliza como los medios de comunicación de chapado siguientes de aislamiento de células. </li></ol></li><li> Preparar dos jeringas de 1 ml equipada con una aguja de 30 Gcon 100 l de heparina (1.000 unidades / ml). </li><li> Cortar un trozo de 5 cm de seda 5-0 quirúrgica. Atar un nudo suelto en la seda quirúrgica con un extremo doble de larga que la otra. Colocar sobre la cánula de calibre 25, pero no apriete. Repita para el otro 25 G cánula. </li><li> Llenar cuatro 35 mm placas de Petri estériles (# 1-4) con 2 ml de, enfriada con hielo, HBSS sin rojo fenol estéril. Mantener en hielo. </li></ol> 2. La eutanasia, el aislamiento del corazón y la canulación <ol><li> Antes del aislamiento del corazón, asegúrese de que la solución de digestión y cónico de 50 ml de solución de parada están calientes. Retire la jeringa llena con HBSS-25 G unida cánula del hielo y colocar en una pinza de bureta (o abrazadera de soporte del anillo) en un soporte de anillo. </li><li> Anestesiar a los ratones utilizando 3% de isofluorano. Confirmar el ratón se anestesia por un toque del dedo del pie en cada extremidad posterior. Si los espasmos en las piernas, el ratón aún no está anestesiado por lo espere 1 minuto y repita el toque del dedo del pie. </li><li> Exponer la vena yugular mediante la eliminación de la piel de unand piel en la parte anterior del cuello con unas tijeras. A continuación, el uso de fórceps para quitar cuidadosamente la grasa que rodea la vena yugular. Después de la eliminación de grasa, inyectar lentamente 100 l de heparina (1.000 unidades / ml). Coloque una esponja quirúrgica sobre la vena para evitar el sangrado excesivo. </li><li> Después de 1 minuto, a tórax abierto para exponer el corazón, corazón ascensor con pinzas curvas y consumo de la que el uso de tijeras, asegurándose de mantener intacta la aorta ascendente a través de la primera rama braquiocefálico. Inmediatamente colocar el corazón en una placa de 35 mm (# 1) con helado de HBSS sin rojo fenol y enjuague. Nota: Realice los siguientes 4 pasos con un microscopio de disección. </li><li> Posicionar el 25 G cánula que se monta en el soporte de anillo en un ángulo de 45 ° para que la punta se encuentra justo debajo de la superficie de HBSS enfriado con hielo en un plato # 2 y es claramente visible a través del microscopio de disección. Transferir el corazón al plato # 2. </li><li> El uso de pinzas Dumont, exponer la aorta quitando suavemente el exceso de tejido adiposo mediante disección roma appunción revenir o desgarro de la aorta. A continuación, el uso de fórceps para deslizar la aorta por encima del 25 G cánula. </li><li> Guía de la cánula hacia abajo a través de la aorta, cerca de, pero no más allá de la válvula aórtica, que pondrá en peligro la integridad de la válvula y por lo tanto, la perfusión retrógrada. Una vez que la cánula está en su lugar, deslice la seda pre-atada sobre la aorta, y apriete. Ate un segundo nudo para formar un nudo cuadrado alrededor de la aorta para garantizar el corazón. </li><li> Una vez que la aorta está ligado de forma segura, lave cuidadosamente el resto de la sangre de la circulación coronaria con el HBSS enfriado con hielo en la jeringa conectada a la cánula 25 G. Tenga cuidado de no empujar demasiado para evitar la presión excesiva coronaria. Sólo se requiere un color muy lento y suave para completar la descarga. canulación aórtica sin fugas también se puede observar en esta suave al ras. </li><li> Encienda la bomba de perfusión para iniciar el flujo de HBSS. Retire la cánula 25 G (adjunta con el corazón) de la jeringa llena de HBSS, teniendo cuidado demantener el cubo de la cánula llena con HBSS, y conectarlo a los serpentines de calefacción calientes rellenos de HBSS. Comience la perfusión del corazón con la bomba de perfusión a una velocidad de 0,5 ml / min durante 8 min. </li><li> Después de la primera corazón se canula y se perfundió en el sistema, repita los pasos 2.1 a 2.8 para el segundo corazón. Estos aislamientos serán escalonados para cada corazón, por lo tanto se requiere una cuidadosa planificación y el calendario. </li></ol> 3. La digestión <ol><li> Después de lavar con HBSS, cambiar la 10 ml jeringa HBSS actualmente en la bomba para uno lleno con 10 ml de solución de digestión pre-calentado. Perfundir cada corazón con solución de digestión de 12 minutos a una velocidad de 0,5 ml / min. No recoger las fracciones derivadas de esta primera digestión, ya que contendrá cualquier sangre remanente y las células endoteliales. </li><li> Después de 12 min, cambiar la velocidad de perfusión de 0,4 ml / min, colocar una cónica 15 ml (A1 tubo o B1, correspondiente a la primera o segunda corazón para cada digestión) lleno de solut parada fríaión en un cubo de hielo, bajo el corazón con el fin de iniciar la recopilación de perfusión CMLV enriquecida. </li><li> Después de 15 min, cambiar el cónica colección para A2 tubo o tubo B2 y cónica giro A1 y B1 en 89 xg durante 10 min inmediatamente después de la recogida de las dos fracciones. Cuando la jeringa llena con la solución de la digestión de la bomba con menos de 1 ml de solución, reemplazar con un llenado recién jeringa 10 ml de solución de digestión. </li><li> Después de la centrifugación, aspirado de sobrenadante de cada tubo de recogida, dejando aproximadamente 0,5 ml. Resuspender pellet de A1 con 2 ml de solución de parada en caliente (o medio de siembra). Añadir resuspensión del tubo de A1 a B1 tubo y el tubo lugar en la incubadora a 37ºC con la tapa suelta. </li><li> Repita los pasos 3.3 y 3.4 hasta que todos los tubos (a A6 y B6) se utilizan durante un tiempo total de 90 min de recogida. A 80 minutos de la digestión, cortar el ápice del corazón para eliminar cualquier célula que pueden estar atrapadas dentro del ventrículo y recoger estas células en el tubo A6 y B6, respectively. Nota: De vez en cuando el corazón se caerá la cánula antes del punto de tiempo de 90 min. Si esto ocurre, recuperar el corazón y el lugar en un 35 mm placa de Petri estéril llena con 2 ml de solución de digestión. Cortar la punta del corazón y enjuagar suavemente el corazón con solución de digestión. A continuación, filtrar los 2 ml de solución de digestión a través de un colador de células estéril micras 100 en una cónica 50 ml y añadir a A6 tubo o B6. </li><li> Después de cada giro de los tubos subsiguientes (A2 y B2), añadir las CMLV resuspenderse para el tubo de recogida anterior (combinado A1 y B1). Además, tenga cuidado de no dejar que la solución de digestión en la bomba y se queda sin cambiar las jeringas de 10 ml como sea necesario a lo largo de la digestión. </li><li> Después de que todos los tubos se combinan, se centrifuga la suspensión VSMC-rico a 89 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar tanto sobrenadante de los tubos de recogida como sea posible. Resuspender el sedimento restante en 2 ml de chapado medios de comunicación y la placa en una placa de cultivo de 35 mm. Lugar placa de cultivo in incubadora a 37ºC durante 24 horas. </li></ol> 4. Cultura de la célula Nota: Complete los pasos restantes de la cabina de bioseguridad. <ol><li> Después de 24 horas, aspirar suavemente el medio de siembra. La cultura tendrá normalmente una gran cantidad de escombros. Para lavar las células, añadir 2 ml de tibia, PBS estéril y golpee suavemente el plato contra dos dedos mientras se gira en sentido horario. </li><li> Después de girar 360 °, aspirar el PBS y repetir una segunda vez. Aspirar el PBS y añadir otros 2 ml de PBS estéril, caliente. Compruebe la placa de cultivo bajo el microscopio para asegurarse de que hay muy poco o ningún residuo en la placa. confluencia celular también se puede determinar en este momento. </li><li> Si los desechos se mantiene en la placa de cultivo, repita el paso 4.2. Si la placa de cultivo esté libre de escombros, aspirar el PBS y añadir 2 ml de medio de siembra caliente. </li><li> Después de 24 horas, se lavan las células una vez más con agua tibia, PBS estéril para eliminar cualquier residuo final o células muertas de la cultura. Aspirar el PBS y pata para otros 2 ml de medio de siembra caliente en las células. </li><li> Comprobar en las células de todos los días y alimentar cada 48 h con medio de siembra frescas calentado. En este punto, las células se pueden utilizar para ensayos de cultivo celular estándar. CMLV deben ser aproximadamente 80% confluentes 4-5 días después de la siembra, aunque puede tardar hasta 7 días hasta que se perfeccionó el procedimiento. Si la división de pasajes posteriores, utilice un máximo de 1: 4 platos de 35 mm (o de un área comparable de placas de cultivo). </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El propósito de este estudio fue adaptar los protocolos de aislamiento de células existentes para aumentar el rendimiento de liso vascular coronaria del corazón murino. La mayor parte del trabajo pionero en la biología del músculo liso vascular se realizó con células de músculo liso de aorta de rata cultivadas. Estos estudios proporcionan conocimientos fundamentales de los mecanismos moleculares que controlan el crecimiento de VSMC, migración y la hipertrofia 7. Sin embargo, como el campo avanzaba, s...

El objetivo de este método es aislar células de músculo liso vascular (CMLV) de la circulación coronaria murino para uso en cultivo de células y ensayos de cultivo celular estándar. Hemos desarrollado esta técnica para evaluar los mecanismos moleculares de la remodelación vascular en diabetes. Hemos informado anteriormente hacia el interior remodelación hipertrófica en las arteriolas coronarias septales en el modelo de ratón db / db de la diabetes 1. Debido a la limitada cantidad de tejido que se encuentra en las coronarias septales murinos, técnicas experimentales estándar que investigan cambios en las proteínas (por ejemplo, Western blot) en ratones db / db y de control son difíciles en el mejor. Además, hemos demostrado previamente que el bloqueador del receptor de angiotensina (ARB) losartán reduce la remodelación observada en los ratones db / db 2. Por lo tanto, el aislamiento de las CMLV primarias de la circulación coronaria nos permite investigar más a fondo los cambios en las CMLV fenotipo o vías de señalización activadas en ratones diabéticos, que pueden ser contribuciónting a la remodelación de las arteriolas coronarias adverso. Numerosos estudios han dilucidado vías de señalización canónica utilizando CMLV aislados de aorta de roedores, en lugar de en cada lecho vascular específico. Sin embargo, hemos demostrado vascular-cama remodelación específico en coronaria, la aorta, y circulaciones mesentéricos de ratones db / db 1, lo que sugiere las CMLV en cada lecho vascular puede ser diferente. Por lo tanto, es necesario aislar CMLV de cada lecho vascular con el fin de comprender mejor los cambios patológicos que se producen en cada conjunto de CMLV. Hay una gran cantidad de diferentes métodos para el aislamiento y cultivo de las CMLV de la aorta. Sin embargo, en la actualidad, sólo hay un estudio que se ha publicado sobre el aislamiento de CMLV desde el ratón circulación coronaria 3. Teng et al. fue el primero en informar de un método para aislar CMLV de la circulación coronaria del ratón; Sin embargo, hemos modificado el protocolo de manera significativa, ya que también aislaron cel endotelialls. Otros laboratorios también han utilizado el protocolo de Teng et al. Aislar miocitos arteriales coronarias y de las vías respiratorias células musculares lisas 4,5. Las alteraciones que hemos incorporado producirán una población de células altamente enriquecida para CMLV de la circulación coronaria. La perfusión retrógrada del corazón de los mamíferos aislado, o la técnica de Langendorff, se estableció en 1897 por Oscar 6 Langendorff y sigue siendo ampliamente utilizado hoy en día para el aislamiento de células cardiovasculares. La técnica que aquí se presenta, junto con el avance de las modificaciones genéticas modernas murinos, proporciona una valiosa herramienta para la investigación más profunda del comportamiento molecular de CMLV de la circulación coronaria.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Fisher</td><td>MT-25-060</td><td></td></tr><tr><td>Primocin - 20 ml</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 10 mM 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut 200 mM - Gibco</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 100 &amp;micro;m nylon mesh</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td><td>Fisher</td><td>12-565-91</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td><td>Fisher</td><td>14-516-124</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type-2&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red)</td><td>Life Technologies</td><td>14170-161</td><td></td></tr><tr><td>5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td><td>Radnoti</td><td>158830</td><td></td></tr><tr><td>11 plus pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water pump</td><td></td><td></td><td>any brand will work</td></tr></tbody></table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

Mientras que el aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular (CMLV) de buques de gran tamaño está bien establecida, hemos tratado de aislar y cultivar las CMLV de la circulación coronaria. Corazones con arcos aórticos intactos se retiraron y se sometieron a perfusión a través de Langendorff retrógrada con solución de digestión que contiene 300 unidades / ml de inhibidor de tripsina de soja ml de colagenasa tipo II, 0,1 mg / 1 y M CaCl 2. Los perfundidos se recogieron a intervalos de 15 min durante 90 min, se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en medio de siembra, y se sembraron en placas de cultivo de tejidos. CMLV se caracterizaron por la presencia de SM22α, α-SMA y vimentina. Una de las principales ventajas del uso de esta técnica es la capacidad de aislar las CMLV de la circulación coronaria de los ratones. Aunque el pequeño número de células obtenidas pueden limitar algunas de las aplicaciones para las que se puedan usar las células, CMLV coronarias aisladas se puede utilizar en una variedad de técnicas de cultivo celular bien establecidos y ASSAys. Los estudios que investigan las CMLV de ratones modificados genéticamente pueden proporcionar más información sobre los procesos de señalización asociados con patologías vasculares estructura-función y.

Debido al aspecto novedoso de nuestra técnica de aislamiento CMLV coronaria, hemos tratado de determinar la pureza de la celda de aislamiento. CMLV coronarias de ratón se identificaron en base a su morfología y tinción de inmunofluorescencia hasta el paso 2. Basándose en la morfología de las células en cultivo después del primer lavado, el procedimiento de aislamiento elimina eficazmente los miocitos cardíacos y las células endoteliales. Las CMLV conservan su morfología hasta ...

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Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

El objetivo de este protocolo es demostrar las técnicas de aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular primaria murino (CMLV) de la circulación coronaria. Una vez que se han aislado CMLV, que se pueden utilizar para muchas técnicas de cultivo estándar.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

isolation-of-murine-coronary-vascular-smooth-muscle-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vistas.  The Ohio State University College of Medicine.  El objetivo de este protocolo es demostrar las técnicas de aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular primaria murino (CMLV) de la circulación coronaria. Una vez que se han aislado CMLV, que se pueden utilizar para muchas técnicas de cultivo estándar. 

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Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Aislamiento y Escisión de murino Aorta; Una técnica versátil en el Estudio de la Enfermedad Cardiovascular

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Investigación

Medicina

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

El aislamiento de los Derechos Humanos de la arteria umbilical células musculares lisas (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Biología

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Neurociencias

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

El aislamiento de la arteria pulmonar células musculares lisas de los ratones recién nacidos

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Aislamiento y Purificación de Pericitas Cardíacos Murinos

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Aislamiento de células endoteliales de ratón coronaria

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of vasoconstriction and vasorelaxation. After isolating the IPA and VSMCs, the characteristics of vascular responses in physiological and pathological conditions can be assessed in the absence of extrinsic factors such as nerve signals, hormones, cytokines, etc. Thus, the IPA and VSMCs serve as excellent models for studying vascular physiology/pathophysiology, along with various experimental investigations, such as modulation by pharmacological agents, patch-clamp electrophysiological analysis, calcium imaging, etc. Here, we have used a technique for isolating the IPA to investigate vascular responses in an organ bath setup. IPA segments were mounted on the organ bath chamber via intraluminal wires and stimulated by various pharmacological agents. The changes in IPA vascular tone (i.e., vasoconstriction and vasorelaxation), were recorded using an isometric force transducer and physiological data analysis software program. We implemented several experimental protocols, which can be adapted to investigate the mechanisms of vasorelaxation/vasoconstriction for studying the pharmacological activities of phytochemical or synthetic drugs. The protocols can also be used to evaluate drugs&#39; roles in modulating various diseases, including pulmonary arterial hypertension. The IPA model allows us to investigate the concentration-response curve, which is crucial in assessing drugs&#39; pharmacodynamic parameters.

Vascular responses of arterial pulmonary circulation can be explored using intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). The present study describes the isolation of IPA in detail and the protocols used for investigating vasorelaxation in response to physiological stimuli.

Aislamiento de la arteria intrapulmonar y las células del músculo liso para investigar las respuestas vasculares

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Aislamiento y separación magnética de células madre murinas CD34+ de la pared vascular

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

Autor destacado: Aislamiento y caracterización mejorados de células madre murinas CD34+ residentes en la pared vascular mediante citometría de flujo acoplada a detección magnética con perla

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

Aislamiento inmunomagnético de células madre CD34+ residentes en la pared vascular de ratones

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...