Los microarrays de ADN y ARN son muy útiles para estudiar las interacciones entre ácidos nucleicos y proteínas, pero también son un método conveniente para la preparación de bibliotecas de secuencias. La fotolitografía permite sintetizar cientos de miles de secuencias únicas en paralelo y actualmente es el único método directo para la síntesis de ARN en microarrays. La síntesis fotolitográfica in situ de microarrays también puede extenderse a oligonucleótidos modificados químicamente, por ejemplo con dos fluoros primos de ácidos nucleicos peptídicos.
Ver el proceso de fabricación y manipulación de microarrays puede ayudar a entender cómo esta compleja maquinaria fue desarrollada a partir de la conocida síntesis de ADN de fase sólida estándar. Comience este procedimiento con el diseño de microarray y la funcionalización de diapositivas como se describe en el protocolo de texto. Encienda el sintetizador de ADN UV LED y su ventilador de refrigeración.
Coloque un medidor de intensidad UV en el punto focal de la luz UV entrante y enciéndalo. En el ordenador, inicie el software WiCell Controller. Encienda e inicialice el dispositivo de micromere.
Cargue un archivo de máscara blanca haciendo clic con el botón derecho en DMD y, a continuación, seleccionando cargar la imagen. Haga clic con el botón derecho en el icono UVS y seleccione UV shutter open. Lea el valor de potencia en el medidor de intensidad y cuente 60 segundos.
Después de 60 segundos, vuelva a leer el valor de potencia y anote los valores inicial y final. Cierre el obturador seleccionando cierre del obturador UV y apague el medidor de intensidad. Calcular el valor medio de intensidad UV en milivatios por centímetro cuadrado.
En el software WiCell, cargue los archivos de trabajo, secuencia y protocolo en sus respectivas subventas y, a continuación, haga clic en Enviar para enviar los archivos de secuencia y protocolo al sintetizador DNA. Para ensamblar la célula de síntesis coloque una junta de perfluoroelastómero grueso en el bloque de cuarzo de la célula. A continuación, coloque una corredera de microscopio funcionalizada y perforada en la parte superior de la primera junta y verifique que los orificios de las diapositivas se conecten con el tubo de entrada y salida de la célula de síntesis.
Coloque una segunda junta fina de politetrafluoroetileno sobre el portaobjetos perforado, rodeando los dos orificios. Por último, coloque una segunda diapositiva funcionalizada pero sin perforar sobre la segunda junta. Ahora coloque un marco de metal de 4 tornillos en la parte superior de la celda de doble sustrato montada Apriete el tornillo a la misma fuerza de sujeción utilizando un destornillador de par.
Conecte el tubo de entrada y salida al sintetizador de ADN. Preparar la línea de lavado de acetonitrilo y verificar el flujo adecuado de acetonitrilo a través de los sustratos. Mida el volumen de acetonitrilo en la línea de desecho después de pasar por siete ciclos de cebado de acetonitrilo.
Este volumen debe ser de dos mililitros. Fije la célula de síntesis en el plano focal de la luz UV entrante. En el caso de la preparación de la biblioteca, coloque una línea de entrada y salida adicional en la parte posterior de la celda y llene la cámara posterior con los dos mililitros de la solución de betacaroteno.
Inicie la síntesis haciendo clic primero en Ejecutar en el software WiCell. En el primer comando de espera en el archivo de trabajo, presione start en el sintetizador DNA. Después de la síntesis de microarrays regulares, desconecte la célula del sintetizador y desmonte la célula.
Utilice una pluma de diamante para grabar el número de síntesis en los portaobjetos de vidrio. Etch el número en la cara no sintetizada de cada diapositiva. Transfiera los portaobjetos a tubos centrífugos de 50 mililitros y guárdelos en un área desecada hasta su uso posterior.
Después de la síntesis de microarrays de biblioteca, primero drenar la solución de betacaroteno fuera de la cámara y luego lavar la cámara dos veces mediante el flujo de cinco mililitros de cloruro de metileno antes de drenar. Para la desprotección de microarry de ADN, llene un frasco de vidrio de tinción con 20 mililitros de etanol y 20 mililitros de EDA. Coloque las microarrays sólo de ADN verticalmente en el frasco, cierre la tapa y deje que las diapositivas se desprotegen durante dos horas a temperatura ambiente.
Después de dos horas, recupere los portaobjetos con pinzas y enjuáguelos bien con agua de doble destilación. Seque los portaobjetos en una centrífuga de microarray durante unos segundos antes de almacenarlas en un desecador. Para la desprotección de la microarray de ARN, prepare una solución seca de 20 mililitros de trietilamina y 30 mililitros de acetonitrilo en un tubo centrífugo de 50 mililitros.
Transfiera un portaarrays de ARN al tubo centrífugo, cierre la tapa y envuelva con película de sellado de plástico. Agitar suavemente el tubo centrífugo en un agitador orbital durante una hora y 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el portaobjetos y lave dos veces con 20 mililitros de acetonitrilo seco antes de secar en una centrífuga de microarray durante unos segundos.
Después del primer paso de desprotección, transfiera el arn arnés a la solución de hidrazina, cierre la tapa y envuelva con película de sellado de plástico. Después de dos horas de agitar suavemente en un agitador orbital, retire el portaobjetos y lávelo dos veces con 20 mililitros de acetonitrilo seco. A continuación, seque en una centrífuga de microarray durante unos segundos.
Si la microarray de ARN también contiene nucleótidos de ADN, proceda con un tercer paso de desprotección. Añadir la microarray DE ADN/ARN a un tubo de 50 mililitros que contenga una solución de EDA-etanol Después de 5 minutos a temperatura ambiente, retire el portaobjetos y lave el microarray dos veces con 20 mililitros de agua estéril. Seque el portaobjetos en una centrífuga de microarray y guárdelo en un desecador.
En un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros, prepare el tampón de hibridación que contiene ADN con etiqueta Cy3, como se describe en el protocolo de texto. Mezclar y vórtice la solución. Coloque cuidadosamente una cámara de hibridación autoadhesiva de 300 microlitrotros sobre el área de síntesis en cada diapositiva y pipeta en la solución de hibridación.
Cubra los orificios de la cámara con puntos adhesivos y envuelva toda la diapositiva en papel de aluminio. Coloque el portaobjetos de microarray en el horno de hibridación, cubra y déjelo girar suavemente a la temperatura de hibridación seleccionada durante dos horas. Después de dos horas, desenganche la corredera, retire la lámina de aluminio, pipetee la solución de hibridación y desgarre cuidadosamente la cámara de hibridación.
Transfiera los portaobjetos a un tubo centrífugo que contenga 30 mililitros de tampón de lavado no estricto. Agitar vigorosamente durante dos minutos a temperatura ambiente. Transfiera el portaobjetos a un tubo centrífugo que contenga 30 mililitros de tampón de lavado estricto y agite vigorosamente durante un minuto.
Por último, transfiera la diapositiva a un tubo centrífugo que contenga 30 mililitros de tampón de lavado final. Agitar durante unos segundos. Seque el portaobjetos en una centrífuga de microarray.
Ahora, coloque la microarray seca, área de síntesis mirando hacia abajo, en el soporte deslizante del escáner de microarray. Para desproteger y cortar las bibliotecas de ADN, sumerja la diapositiva en la solución de escisión, en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Cierre el tubo y envuelva con película de sellado de plástico, antes de girar suavemente en un agitador orbital durante dos horas a temperatura ambiente.
Después de dos horas, retire el portaobjetos y lave dos veces con 20 mililitros de acetonitrilo escrupulosamente seco antes de dejar que se seque al aire. Con una pipeta, aplique 100 microlitros de agua estéril sobre el área de síntesis ahora discernible. Encoge la solución hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces antes de transferirla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Repita el proceso y combine el eluido de microarray en el mismo tubo. Evaporar el chip eluente a sequedad y luego redissolcar en 10 microlitros de H2O libre de nucleasas. Aquí se muestran los resultados de un ensayo de hibridación realizado en una microarray que contiene las versiones de ADN y ARN de una secuencia de 25mer.
El escaneo aparece en un formato de escala verde correspondiente a la excitación, espectro de emisión de fluorescencia Cy3, con intensidad de fluorescencia registrada en unidades arbitrarias. Hay una variabilidad significativa en los valores absolutos de fluorescencia entre los experimentos. Se muestran los resultados de tres síntesis independientes que utilizan los mismos parámetros de fabricación y el mismo manejo post-sintético.
El ADN de 25mer, cuando se hibrida a su cadena de ADN complementaria con etiqueta Cy3, producirá señales de fluorescencia que oscilan entre 20.000 y 30.000, muy raramente por encima o por debajo. El ARN de 25mers, cuando se hibrida al mismo complemento de ADN con la etiqueta Cy3, dará intensidades de fluorescencia en las características correspondientes que van desde 15.000 hasta 20.000. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia de los dúplex de ARN/ADN ocasionalmente caerá por debajo de 8.000, cuando los dúplex de ADN/ADN correspondientes seguirán fluoresce dentro del rango de 20.000 a 30.000.
En tales casos, los resultados del ARN pueden considerarse subóptimos. Al igual que con cualquier otro experimento basado en ARN, es importante recordar que los microarrays de ARN son sensibles a la degradación y deben tratarse en condiciones estériles. Las bibliotecas de ácido nucleico recogidas de microarrays se pueden utilizar en la secuenciación de ADN o ARN, así como en la codificación de información digital sobre el ADN.
El NED produce una luz UV intensa que no debe ser vista directamente. Debido a esto, se recomienda usar gafas protectoras mientras el instrumento está en uso.
