Capture Hi-C permite descifrar la organización de la cromatina 3D de la región genómica de interés de tamaño megabase a alta resolución. Con Capture Hi-C, se logra una mayor resolución y especificidad alélica al tiempo que se mejora la efectividad del tiempo y la asequibilidad de la técnica. La aplicación de Capture IC a diferentes sistemas modelo, tipos de células y paisajes de cromatina regulados por el desarrollo en condiciones de salud y patológicas es probable que facilite nuestra comprensión de la interacción entre la topología del genoma y la regulación génica.
Para comenzar, triptonice y cuente las celdas de la placa de control preparada específicamente para el recuento de células utilizando un contador de celdas automatizado. Incluir tinción de viabilidad para determinar el porcentaje de células viables. A partir de este recuento de células, estime el número total de células en la placa preparada para la reticulación.
Retire el medio de cultivo de las placas preparadas para la reticulación y sustitúyalo por la solución de fijación. Fijar durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo una mezcla suave en una coctelera. Apague la reacción fija agregando 2.5 glicina molar PBS a una concentración final de 0.125 molares.
Agregue 530 microlitros de 2.5 glicina molar PBS a 10 mililitros en una placa de 10 centímetros. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente, mezclando suavemente en una coctelera. Transfiera los platos al hielo e incube durante 15 minutos adicionales en hielo mientras mezcla suavemente en una coctelera.
Retire la solución de fijación de las células virtiéndolo en un vaso de precipitados para garantizar un manejo rápido. Enjuague la placa de 10 centímetros rápidamente dos veces con cinco mililitros de PBS de glicina molar fría de 0,125 para lavar los desechos y las células muertas. Retire el líquido de la placa virtiéndolo en un vaso de precipitados para garantizar un manejo rápido.
Agregue cinco mililitros de PBS de glicina molar 0.125 frío a la placa de 10 centímetros. Y raspe rápidamente las células de la placa con un raspador de células de plástico. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica preenfriado de 50 mililitros utilizando una pipeta serológica.
Enjuague la placa dos veces con cinco mililitros de glicina molar fría 0.125 PBS y agregue la suspensión celular al tubo de centrífuga cónica. Girar hacia abajo a 480 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante aspirando con un sistema de aspiración de sobremesa.
Resuspender las células y alícuota 500 microlitros de la suspensión celular en el número calculado de tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Gire hacia abajo a 480 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y almacene los gránulos de células secas a 80 grados centígrados. Para la lisis celular, descongele los gránulos congelados en hielo.
Prepare 1.5 mililitros de tampón de lisis en agua. Añadir 600 microlitros del tampón de lisis en frío y resuspender bien sobre hielo. Girar hacia abajo a 2, 655 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante utilizando un sistema de aspiración de sobremesa.
Resuspender en 100 microlitros de 0,5% SDS. Después de la incubación a 62 grados centígrados girando a 1400 RPM durante 10 minutos, agregue 290 microlitros de agua más 50 microlitros de 10% Triton X 100, y mezcle bien, evitando burbujas de aire. Incubar a 37 grados centígrados con remolinos a 1400 RPM durante 10 minutos antes de agregar 50 microlitros de 10 X DPN tampón de tubo e invertir el tubo para mezclar.
Tome 50 microlitros de ADN no digerido para el control de calidad en un tubo separado. No olvide tomar la muestra de control no digerida. Para la digestión de DPN2, añadir 10 microlitros de DPN2 de alta concentración y mezclar invirtiendo.
Incubar las muestras y el control no digerido en un mezclador térmico a 37 grados centígrados, girando a 1400 rotaciones por minuto durante más de cuatro horas. Para la ligadura y la reversión de la reticulación, tome 50 microlitros del ADN digerido ligado para el control de calidad en un tubo separado. Guarde los controles no digeridos y no ligados a 20 grados centígrados.
Añadir 800 microlitros de cóctel de ligadura. Incubar a 16 grados centígrados, girando a 1000 rotaciones por minuto durante la noche. Para la purificación del ADN, transfiera las muestras en hielo a tubos de centrífuga cónica de 15 mililitros preenfriados y agregue dos mililitros de agua, 10.5 mililitros de etanol helado y 583 microlitros de acetato de sodio tres molares.
Agregue 200 microlitros de etanol helado, 10.8 microlitros de acetato de sodio y un microlitro del coprecipitante a los controles de calidad no digeridos y ligados. Incubar a menos 80 grados centígrados durante al menos cuatro horas hasta toda la noche. Gire los tubos de 15 mililitros a 2200 G a cuatro grados centígrados durante 45 minutos.
Retire cuidadosamente el etanol y seque al aire las muestras y controle a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. No seque demasiado. Resuspender las muestras y controles en 100 microlitros y 20 microlitros de agua, respectivamente.
Para el control de calidad de la preparación de la plantilla 3C, cargue de 100 a 200 nanogramos de cada muestra y cada control en un gel 1%agros 1XTBE. Luego, para realizar el enriquecimiento objetivo para la secuenciación multiplex de extremo reducido, tome cuatro microgramos de plantilla 3C, resuspenda en 130 microlitros de agua para cada reacción de captura. Sonicar la muestra y continuar la preparación con tres microgramos del ADN cortado.
Para hibridar las muestras preparadas de ADN con las sondas de ARN específicas del objetivo, use 750 nanogramos de muestras de ADN en un volumen final de 3.4 microlitros, lo que resulta en una concentración inicial de 221 nanogramos por microlitro. Utilice la concentración de vacío de velocidad si es necesario para alcanzar el volumen final de 3,4 microlitros. Para muestras resuspendidas en 10 microlitros, 15 a 20 minutos de concentración son suficientes.
Incubar la mezcla de hibridación durante 16 a 18 horas a 65 grados centígrados con una tapa calentada a 105 grados centígrados, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para capturar los fragmentos de ligadura específicos, agregue estreptivide en perlas acopladas a la muestra hibridada de la sonda. Finalmente, para preparar las muestras para la secuenciación múltiple, continúe el protocolo de acuerdo con el sistema de enriquecimiento de objetivos utilizado en este estudio para la secuenciación pareada y multiplexada.
La resolución del mapa de interacción Capture Hi-C permite la identificación de dos dominios más pequeños en el Tsix-tad que contiene el promotor del locus Tsix. Esto no se logró anteriormente con 5C. Además, otras estructuras secundarias, como los bucles de contacto, son claramente visibles a partir de los datos de Capture Hi-C, como el bucle entre Xist y FTX, previamente identificado con Capture C y el bucle entre Xist y Xert recientemente identificado utilizando un protocolo similar para Capture Hi-C.
Otros contactos también se pueden mapear con mayor precisión debido a la mayor resolución de los perfiles Capture Hi-C, como los que forman los puntos de contacto conocidos dentro del Tsix-tad entre los loci Linx, Chic1 y Xite. En comparación con los datos Hi-C mostrados, Capture Hi-C permitió un aumento de cuatro veces en la resolución, sin embargo, solo requirió una cuarta parte de la profundidad de secuenciación. Es muy importante no olvidar tomar 50 microlitros de muestras de ADN no digerido y no ligado como control de calidad para la preparación de la plantilla 3C.
