DNA ו- RNA microarrays הם מאוד שימושי כדי ללמוד את האינטראקציות בין חומצות גרעין וחלבונים, אבל הם גם שיטה נוחה להכנת ספריות רצף. פוטוליטוגרפיה מאפשרת לסנתז מאות אלפי רצפים ייחודיים במקביל והיא כיום השיטה הישירה היחידה לסינתזת רנ"א על מיקרו-ריי. סינתזה פוטוליתוגרפית במקום של microarrays ניתן גם להאריך אוליגונוקלאוטידים שעברו שינוי כימי, למשל עם שני פלואורו ראשוני של חומצות גרעין פפטיד.
לראות את התהליך של ייצור microarray וטיפול יכול לעזור להבין איך זה מכונות מורכבות פותחה מן סינתזת DNA שלב מוצק סטנדרטי ידוע. התחל הליך זה עם עיצוב microarray ופונקציונליזציה של שקופיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפעל את ה-DNA סינתיסייזר UV LED ומאוורר הקירור שלה.
חבר מד עוצמת UV בנקודת המוקד של אור UV נכנס ולהדליק אותו. במחשב, הפעל את תוכנת בקר WiCell. הפעל ואתחל את התקן המיקרו-מיר.
טען קובץ מסיכה לבנה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על DMD ולאחר מכן בחירת תמונת טעינה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על סמל UVS ובחר תריס UV פתוח. קרא את ערך הה הספק במד האינטנסיביות וספיר 60 שניות.
לאחר 60 שניות, קרא שוב את ערך צריכת החשמל ושים לב לערכי ההתחלה והסיום. סגור את התריס על ידי בחירת תריס UV סגור ולכבות את מד האינטנסיביות. חשב את ערך עוצמת UV הממוצע במילי וואט לריבוע סנטימטר.
בתוכנת WiCell, טען את קבצי המשימה, הרצף והפרוטוקול בחלונות המשנה המתאימים שלהם, ולאחר מכן לחץ על שלח כדי לשלוח את קבצי הרצף והפרוטוקול לסינתיסייזר ה- DNA. כדי להרכיב את תא הסינתזה מניחים אטם perfluoroelastomer עבה על בלוק הקוורץ של התא. לאחר מכן מקם מגלשת מיקרוסקופ פונקציונלית שנקדחה על גבי אטם האגם הראשון, וודא כי החורים במגלשות מתחברים עם צינורות השקע והשקע של תא הסינתזה.
מניחים אטם polytetrafluoroethylene שני, דק מעל המגלשה שנקדחה, המקיף את שני החורים. לבסוף, מניחים שקופית שנייה, פונקציונלית אך לא מסולסולת על גבי אטם השני. כעת הנח מסגרת מתכת של 4 ברגים על גבי תא המצע הכפול שהורכב הדק את המברג לאותו כוח הידוק באמצעות מברג מוטו.
חבר את צינורות השקע והשקע לסינתיסייזר הדנ"א. ראש קו שטיפת אצטוניטריל ולאמת את הזרימה הנכונה של אצטוניטריל דרך המצעים. למדוד את נפח האצטוניטריל בקו הפסולת לאחר שעבר שבעה מחזורים של priming אצטוניטריל.
נפח זה צריך להיות שני מיליליטר. חבר את תא הסינתזה במישור המוקד של אור UV נכנס. במקרה של הכנת הספרייה, לצרף עוד inlet קו שקע בחלק האחורי של התא ולמלא את התא האחורי עם שני מיליליטר של פתרון betacarotene.
התחל את הסינתזה על ידי לחיצה ראשונה על הפעל בתוכנת WiCell. בפקודת ההמתנה הראשונה בקובץ המשימה, לחץ על התחל בסינתיסייזר הדנ"א. לאחר סינתזה של microarrays רגיל, לנתק את התא מן הסינתיסייזר, ולפרק את התא.
השתמש בעט יהלום כדי תחריט את מספר הסינתזה על מגלשות הזכוכית. תחריט את המספר על הפנים הלא מסונתזות של כל שקופית. מעבירים את השקופיות לצינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר ולאחסן באזור מיובש עד לשימוש נוסף.
לאחר הסינתזה של microarrays הספרייה, תחילה לנקז את פתרון betacarotene מתוך התא ולאחר מכן לשטוף את התא פעמיים על ידי זורם חמישה מיליליטר של מתילן כלוריד דרך לפני ניקוז. לקבלת דנ"א microarry deprotection, למלא צנצנת ויטראז'ים עם 20 מיליליטר של אתנול ו 20 מיליליטר של EDA. מניחים את המיקרו-ארקים של הדנ"א בלבד אנכית בצנצנת, סוגרים את המכסה ומשאירים את המגלשות כדי להתרכך במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר שעתיים, לאחזר את המגלשות באמצעות פינצטה ולשטוף אותם ביסודיות עם מים מזוקקים כפול. יבש את השקופיות בצנטריפוגה microarray במשך כמה שניות לפני אחסון אותם במייבש. עבור RNA microarray deprotection, להכין פתרון יבש של טריאתילאמין 20 מיליליטר ו 30 מיליליטר אצטוניטריל בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.
מעבירים מגלשת RNA microarray אחת לתוך צינור הצנטריפוגה, סוגרים את המכסה ועוטפים בסרט איטום מפלסטיק. לנער בעדינות את צינור הצנטריפוגה על שייקר מסלולית במשך שעה ו -30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר את השקופית ולשטוף פעמיים עם 20 מיליליטר של אצטוניטריל יבש לפני ייבוש צנטריפוגה microarray במשך כמה שניות.
לאחר שלב deprotection הראשון להעביר את השקופית RNA לתוך פתרון הידרצין הידראט, לסגור את המכסה לעטוף עם סרט איטום פלסטיק. לאחר שעתיים של טלטול עדין על שייקר מסלולית, להסיר את המגלשה ולשטוף אותו פעמיים עם 20 מיליליטר של אצטוניטריל יבש. ואז להתייבש בצנטריפוגה microarray במשך כמה שניות.
אם RNA microarray מכיל גם נוקלאוטידים DNA, להמשיך עם שלב deprotection שלישי. מוסיפים את ה-DNA /RNA microarray לצינור 50 מיליליטר המכיל פתרון אחד לאחד EDA-אתנול לאחר 5 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את המגלשה, ולשטוף את microarray פעמיים עם 20 מיליליטר של מים סטריליים. יבש את השקופית בצנטריפוגה microarray ולאחסן במייבש.
בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר, הכן את מאגר ההכלאה המכיל DNA המסומן ב- Cy3, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מערבבים ומערבולת את הפתרון. בזהירות למקם תא הכלאה עצמית דבק 300 microliter מעל אזור הסינתזה על כל שקופית pipet בתסמת ההכלאה.
מכסים את חורי התא בנקודות דבק ועוטפים את כל השקופית בנייר אלומיניום. מניחים את המיקרו-ריי מחליקים לתנור ההכלאה, מכסים ומניחים לו להסתובב בעדינות בטמפרטורת ההכלאה שנבחרה למשך שעתיים. לאחר שעתיים, לנתק את השקופית, להסיר את רדיד אלומיניום, pipette את פתרון ההכלאה, בזהירות לקרוע את תא ההכלאה.
העבר את השקופיות לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 30 מיליליטר של מאגר שטיפה לא מחמירות. יש לנער במרץ במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את השקופית לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 30 מיליליטר של חיץ שטיפה מחמירה לנער במרץ במשך דקה אחת.
לבסוף, להעביר את השקופית לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 30 מיליליטר של חיץ לשטוף הסופי. לנער לכמה שניות. ייבש את המגלשה בצנטריפוגה מיקרו-ריי.
עכשיו, למקם את microarray יבש, אזור סינתזה פונה כלפי מטה, במחזיק השקופית של סורק microarray. כדי להפוך את ספריות הדנ"א לחסימות ולחשוף אותן, טבול את הגלישה בתסכול המחשוף, בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. סוגרים את הצינור ועוטפים בסרט איטום מפלסטיק, לפני שמסתובבים בעדינות בשייקר מסלולי למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר שעתיים, להסיר את המגלשה ולשטוף פעמיים עם 20 מיליליטר של אצטוניטריל יבש בקפידה לפני לתת לו אוויר יבש. עם פיפטה, להחיל 100 microliters של מים סטריליים על אזור הסינתזה עכשיו ניכר. צינור את הפתרון למעלה ולמטה כמה פעמים לפני העברתו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
חזור על התהליך ולשלב את microarray eluate לתוך אותו צינור. להתאדות את השבב להתרומם עד יובש ולאחר מכן להתיז מחדש לתוך 10 microliters של H2O ללא גרעין. להלן תוצאות בדיקת הכלאה המבוצעת על מיקרו-ריי המכילה את גרסאות הדנ"א וה-RNA של רצף של 25 מ"ר.
הסריקה מופיעה בפורמט ירוק התואם את העירור, ספקטרום הפליטה של פלואורסצנטיות Cy3, עם עוצמת פלואורסצנטיות נרשמת ביחידות שרירותיות. קיימת שונות משמעותית בערכי הפלואורסצנטיות המוחלטת בין הניסויים. התוצאות עבור שלושה סינתזות עצמאיות באמצעות אותם פרמטרי ייצור ואותו טיפול פוסט סינתטי מוצגות.
הדנ"א 25mer, כאשר היברידית לגדיל ה-DNA המשלים שלה Cy3 שכותרתו, תניב אותות פלואורסצנטיים הנעים בין 20, 000 ל 30, 000, לעתים רחוקות מאוד מעל או מתחת. RNA 25mer, כאשר היברידית לאותה השלמה DNA Cy3 שכותרתו, ייתן שפע פלואורסצנטי על התכונות המתאימות הנעות בין 15, 000 עד 20, 000. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנטיות של דופלקסים RNA / DNA יירד מדי פעם מתחת 8, 000, כאשר דופלקס DNA / DNA המתאים עדיין פלואורסצנטי בטווח 20, 000 עד 30, 000.
במקרים כאלה, התוצאות עבור RNA עשוי להיחשב תת אופטימלי. כמו בכל ניסוי אחר המבוסס על RNA חשוב לזכור כי מיקרו-ריי RNA רגישים להשפלה, ויש לטפל בהם בתנאים סטריליים. ניתן להשתמש בספריות חומצות גרעין שנאספו ממיקרו-ריי ברצף DNA או RNA וכן בקידוד מידע דיגיטלי על דנ"א.
NED מייצר אור UV אינטנסיבי אשר לא צריך להיות הסתכל ישירות. בגלל זה, מומלץ ללבוש משקפי מגן בזמן המכשיר נמצא בשימוש.
