DNA와 RNA 마이크로어레이는 핵산과 단백질 간의 상호 작용을 연구하는 데 매우 유용하지만 서열 라이브러리의 제조를위한 편리한 방법입니다. 포토리스소그래피는 수십만 개의 독특한 서열을 병렬로 합성할 수 있으며 현재 마이크로어레이에서 RNA 합성을 위한 유일한 직접적인 방법입니다. 마이크로어레이의 시투 광리토그래피 합성은 또한 펩타이드 핵산의 두 가지 주요 플루오로, 예를 들어 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드로 확장될 수 있다.
마이크로어레이 제조 및 취급 과정을 보는 것은 이 복잡한 기계가 잘 알려진 표준 고체 상 DNA 합성에서 어떻게 개발되었는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마이크로어레이 설계 및 슬라이드 기능화로 이 절차를 시작합니다. DNA 신디사이저 UV LED와 냉각 팬을 켭니다.
들어오는 UV 빛의 초점에 UV 강도 미터를 부착하고 켭니다. 컴퓨터에서 WiCell 컨트롤러 소프트웨어를 시작합니다. 마이크로미어 장치를 켜고 초기화합니다.
DMD를 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 로드 이미지를 선택하여 모든 흰색 마스크 파일을 로드합니다. UVS 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 UV 셔터를 엽니다. 강도 미터의 전력 값을 읽고 60초 를 계산합니다.
60초 후에 전원 값을 다시 읽고 시작 및 끝 값을 기록합니다. UV 셔터를 선택하여 셔터를 닫고 강도 측정기를 끕니다. 밀리와트미터 정사각형의 평균 UV 강도 값을 계산합니다.
WiCell 소프트웨어에서 작업, 시퀀스 및 프로토콜 파일을 각 하위 창에 로드한 다음 전송을 클릭하여 시퀀스 및 프로토콜 파일을 DNA 신디사이저로 보냅니다. 합성 세포를 조립하기 위해 세포의 석영 블록에 두꺼운 퍼플루오로엘라스토머 개스킷을 배치합니다. 그런 다음 첫 번째 개스킷 위에 드릴링된 기능성 현미경 슬라이드를 놓고 슬라이드의 구멍이 합성 셀의 입구 및 출구 튜브와 연결되어 있는지 확인합니다.
두 개의 구멍을 둘러싸고 드릴슬라이드 위에 두 번째 얇은 폴리테트라플루오로틸렌 개스킷을 놓습니다. 마지막으로 두 번째 개스킷 위에 두 번째 기능적이지만 드릴되지 않은 슬라이드를 놓습니다. 이제 조립 된 이중 기판 셀 위에 4 나사 금속 프레임을 배치토크 스크류 드라이버를 사용하여 동일한 클램핑 힘에 나사를 조인.
인렛과 콘센트 튜브를 DNA 신디사이저에 부착합니다. 아세토닐워시 라인을 프라임하고 기판을 통해 아세토나이트의 적절한 흐름을 확인합니다. 아세토닐프릴 프라이밍의 7주기를 통과한 후 폐기물 라인에서 아세토나이트의 양을 측정합니다.
이 볼륨은 2밀리리터여야 합니다. 들어오는 UV 광의 초점 평면에 합성 셀을 부착합니다. 라이브러리 준비의 경우, 셀 의 뒷면에 여분의 입구와 콘센트 라인을 부착하고 베타 카로틴 용액의 두 밀리리터로 후면 챔버를 채웁니다.
WiCell 소프트웨어에서 실행을 먼저 클릭하여 합성을 시작합니다. 작업 파일의 첫 번째 대기 명령에서 DNA 신디사이저에서 시작하십시오. 일반 마이크로 어레이를 합성한 후 합성기에서 세포를 분리하고 셀을 분해합니다.
다이아몬드 펜을 사용하여 합성 번호를 유리 슬라이드에 새겨 두십시오. 각 슬라이드의 합성되지 않은 면에 숫자를 각으로 채착합니다. 슬라이드를 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 추가 사용이 이될 때까지 건조된 지역에 보관하십시오.
라이브러리 마이크로어레이의 합성 후, 먼저 챔버에서 베타 카로틴 용액을 배출 한 다음 배수하기 전에 메틸렌 염화물의 5 밀리리터를 흐르고 챔버를 두 번 세척합니다. DNA 미세 아리 보호의 경우, 에탄올 20 밀리리터와 EDA의 20 밀리리터로 염색 유리 항아리를 채웁니다. DNA 전용 마이크로어레이를 항아리에 수직으로 놓고 뚜껑을 닫고 슬라이드를 그대로 두어 실온에서 2시간 동안 보호합니다.
2시간 후 핀셋을 사용하여 슬라이드를 검색하고 이중 증류수로 완전히 헹구십시오. 슬라이드를 미세 배열 원심분리기로 몇 초 간 건조한 후 건조기에 보관하십시오. RNA 마이크로어레이 보호의 경우 50밀리리터 원심분리기 튜브에 20밀리리터 트리에틸라민과 30밀리리터 아세토니트리얼의 건조 액수를 준비한다.
원심분리기 튜브에 RNA 마이크로어레이 슬라이드 1개를 옮기고 뚜껑을 닫고 플라스틱 밀봉 필름으로 포장합니다. 원심분리기 튜브를 실온에서 1시간 30분 동안 궤도 셰이커에 부드럽게 흔들어 줍니다. 다음으로, 슬라이드를 제거하고 몇 초 동안 마이크로 어레이 원심 분리기에서 건조하기 전에 건조 아세토나이트20 밀리리터로 두 번 세척하십시오.
첫 번째 보호 제거 단계에 따라 RNA 슬라이드를 하이드라진 수화물 용액으로 옮기고 뚜껑을 닫고 플라스틱 밀봉 필름으로 감쌉니다. 궤도 셰이커에서 부드럽게 흔들리는 2 시간 후, 슬라이드를 제거하고 건조 아세토나이트의 20 밀리리터로 두 번 세척합니다. 그런 다음 마이크로 어레이 원심분리기에서 몇 초 동안 건조시.
RNA 마이크로어레이가 DNA 뉴클레오티드도 포함되어 있는 경우 제3의 보호 조치를 진행한다. DNA/RNA 마이크로어레이를 실온에서 5분 후에 1대 1EDA-에탄올 용액을 포함하는 50밀리리터 튜브에 DNA/RNA 마이크로어레이를 추가하고, 슬라이드를 제거하고, 멸균수 20밀리리터로 마이크로어레이를 두 번 세척합니다. 마이크로어레이 원심분리기에서 슬라이드를 건조시키고 건조기에 보관하십시오.
1.5 밀리리터 멸균 마이크로센심분리기 튜브에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Cy3 라벨 DNA를 함유한 혼성화 버퍼를 준비한다. 액액을 혼합하고 소용돌이시다. 혼성화 용액의 각 슬라이드 및 파이프에 합성 영역에 자체 접착제 300 마이크로리터 혼성화 챔버를 신중하게 배치합니다.
접착제 점으로 챔버의 구멍을 덮고 알루미늄 호일에 전체 슬라이드를 감쌉니까. 마이크로어레이 슬라이드를 하이브리드화 오븐에 넣고 뚜껑을 덮고 선택한 혼성화 온도에서 2시간 동안 부드럽게 회전하게 합니다. 2시간 후, 슬라이드를 분리하고, 알루미늄 호일을 제거하고, 혼성화 용액을 피펫을 제거하고, 혼성화 챔버를 조심스럽게 떼어낸다.
미약세척 버퍼 30밀리리터가 포함된 원심분리기 튜브로 슬라이드를 옮기합니다. 실온에서 2분간 힘차게 흔들어 주세요. 슬라이드를 30밀리리터의 엄격한 세척 버퍼가 들어 있는 원심분리기 튜브로 옮기고 1분 동안 힘차게 흔들어 줍니다.
마지막으로 슬라이드를 최종 세척 버퍼 30 밀리리터가 들어있는 원심분리기 튜브로 옮겨 넣습니다. 몇 초 동안 흔들어주세요. 마이크로어레이 원심분리기에서 슬라이드를 건조시합니다.
이제 마이크로어레이 스캐너의 슬라이드 홀더에 건조 마이크로어레이, 합성 영역을 아래로 향합니다. DNA 라이브러리를 보호 해제하고 절단하려면 50밀리리터 원심분리기 튜브에 슬라이드를 분열 용액에 담가 둡니다. 튜브를 닫고 플라스틱 밀봉 필름으로 감싸고 실온에서 2 시간 동안 궤도 셰이커에서 부드럽게 회전하십시오.
2시간 후, 슬라이드를 제거하고 20 밀리리터의 꼼꼼하게 건조한 아세토나이트로 두 번 세척한 후 공기를 건조시키십시오. 파이펫을 사용하면 현재 식별 가능한 합성 영역에 멸균 수분 100 마이크로리터를 적용합니다. 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 전송하기 전에 솔루션을 몇 번 위아래로 파이프합니다.
공정을 반복하고 마이크로 어레이용액을 동일한 튜브로 결합합니다. 칩용염을 증발하여 건조한 다음 핵이 없는 H2O 10마이크로리터로 재용해집니다. 여기에 25mer 서열의 DNA 및 RNA 버전을 포함하는 마이크로어레이상에서 수행된 혼성화 분석의 결과가 나와 있다.
스캔은 임의 단위로 기록된 형광 강도와 함께 Cy3 형광의 발산, 방출 스펙트럼에 해당하는 녹색 스케일 형식으로 나타납니다. 실험 사이에는 절대 형광 값에 상당한 가변성이 있습니다. 동일한 제작 매개 변수와 동일한 합성 후 처리를 사용하여 세 개의 독립적인 신디사이저에 대한 결과가 표시됩니다.
25mer DNA는 상호 보완적인 Cy3 라벨 DNA 가닥에 혼성화될 때, 20, 000에서 30, 000에 이르는 어느 곳에서나 형광 신호를 산출할 것입니다. 25mer RNA는 동일한 Cy3 라벨 DNA 보완에 혼성화될 때, 15, 000에서 20, 000에 이르는 해당 기능에 형광 강도를 줄 것이다. 그러나, RNA/DNA 이중제의 형광 강도는 때때로 8, 000 이하로 떨어질 것이고, 해당 DNA/DNA 이중이 20, 000 에서 30, 000 범위 내에서 여전히 형광이 될 때.
이러한 경우, RNA에 대한 결과는 최적이라고 간주될 수 있다. 다른 RNA 기반 실험과 마찬가지로 RNA 마이크로어레이는 저하에 민감하며 멸균 조건하에서 처리되어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 마이크로어레이로부터 수집된 핵산 라이브러리는 DNA 또는 RNA 시퀀싱뿐만 아니라 DNA에 대한 디지털 정보의 인코딩에 사용될 수 있다.
NED는 직접 볼 수 없는 강렬한 UV 광을 생성합니다. 이 때문에, 악기가 사용되는 동안 보호 고글을 착용하는 것이 좋습니다.
