Microréseaux d'ADN et d'ARN à haute densité - Synthèse photolithographique, hybridation et préparation des grandes bibliothèques d'acide nucléique

Les microrésaires d’ADN et d’ARN sont très utiles pour étudier les interactions entre les acides nucléiques et les protéines, mais ils sont aussi une méthode pratique pour la préparation des bibliothèques de séquences. La photolithographie permet de synthétiser des centaines de milliers de séquences uniques en parallèle et est actuellement la seule méthode directe de synthèse de l’ARN sur les microrésages. La synthèse photolithographique in situ des microrésaires peut également être étendue aux oligonucléotides chimiquement modifiés, par exemple avec deux fluoro premiers d’acides nucléiques peptidiques.

Voir le processus de fabrication et de manipulation du microarray peut aider à comprendre comment cette machinerie complexe a été développée à partir de la synthèse standard bien connue de l’ADN de phase solide. Commencez cette procédure par la conception du microrése et la fonctionnalisation des diapositives décrites dans le protocole textuel. Allumez le synthétiseur d’ADN UV LED et son ventilateur de refroidissement.

Fixez un compteur d’intensité UV au point focal de la lumière UV entrante et allumez-la. Sur l’ordinateur, démarrez le logiciel WiCell Controller. Allumez et initialisez le dispositif de micromère.

Chargez un fichier masque tout blanc en cliquant à droite sur DMD, puis en sélectionnant l’image de charge. Cliquez à droite sur l’icône UVS et sélectionnez obturateur UV ouvert. Lisez la valeur de puissance sur le compteur d’intensité et comptez 60 secondes.

Après 60 secondes, relisez la valeur de puissance et notez les valeurs de début et de fin. Fermez l’obturateur en sélectionnant l’obturateur UV fermer et éteindre le compteur d’intensité. Calculer la valeur moyenne d’intensité UV en milliwatts par centimètre carré.

Dans le logiciel WiCell, chargez le travail, la séquence et les fichiers de protocole dans leurs sous-fenêtres respectives, puis cliquez sur envoyer pour envoyer les fichiers séquence et protocole au synthétiseur d’ADN. Pour assembler la cellule de synthèse placer un joint perfluoroelastomer épais sur le bloc de quartz de la cellule. Placez ensuite une lame de microscope forée et fonctionnalisée sur le premier joint et vérifiez que les trous sur les glissières se connectent à l’entrée et au tube de sortie de la cellule de synthèse.

Placez un deuxième joint mince en polytétrafluoroéthylène au-dessus de la glissière forée, entourant les deux trous. Enfin, placez une deuxième glissière fonctionnalisée mais non triée au sommet du deuxième joint. Maintenant, placez un cadre en métal à 4 vis sur le dessus de la cellule à double substrat assemblé Serrer la vis à la même force de serrage à l’aide d’un tournevis de couple.

Attachez l’entrée et le tube de sortie au synthétiseur d’ADN. Amorcez la ligne de lavage de l’acétyonitrile et vérifiez l’écoulement approprié de l’acéonitrile à travers les substrats. Mesurer le volume d’acétylisation à la ligne de déchets après avoir traversé sept cycles d’amorçage de l’acétylisation.

Ce volume doit être de deux millilitres. Fixez la cellule de synthèse au plan focal de la lumière UV entrante. Dans le cas de la préparation de la bibliothèque, fixez une entrée supplémentaire et une ligne de sortie à l’arrière de la cellule et remplissez la chambre arrière avec les deux millilitres de la solution de bêtacarotène.

Démarrez la synthèse en cliquant d’abord sur Exécuter dans le logiciel WiCell. Lors de la première commande d’attente dans le dossier d’emploi, appuyez sur démarrer sur le synthétiseur d’ADN. Après la synthèse des microréseau réguliers, déconnecter la cellule du synthétiseur, et démonter la cellule.

Utilisez un stylo diamant pour graver le numéro de synthèse sur les glissières en verre. Étchage le nombre sur le visage non synthétisé de chaque diapositive. Transférer les glissières dans des tubes de centrifugeuse de 50 millilitres et les conserver dans une zone desséchée jusqu’à nouvel usage.

Après la synthèse des microrésaires de bibliothèque, égouttez d’abord la solution de bêtacarotène hors de la chambre puis lavez la chambre deux fois en coulant cinq millilitres de chlorure de méthylène à travers avant de s’écouler. Pour la dépprotection des microarres d’ADN, remplissez un bocal en verre souillé de 20 millilitres d’éthanol et de 20 millilitres d’EDA. Placez les microrésaisons à ADN uniquement verticalement dans le bocal, fermez le couvercle et laissez les glissières se déprodent pendant deux heures à température ambiante.

Après deux heures, récupérer les glissières à l’aide d’une pince à épiler et les rincer soigneusement à l’eau double distillée. Séchez les glissières dans une centrifugeuse de microarray pendant quelques secondes avant de les stocker dans un dessiccateur. Pour la dépprotection du microrésexe arn, préparez une solution sèche de triéthylamine de 20 millilitres et d’acétyltrile de 30 millilitres dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres.

Transférer une glissière de microrésais ARN dans le tube de centrifugeuse, fermer le couvercle et envelopper avec un film d’étanchéité en plastique. Agiter doucement le tube de centrifugeuse sur un shaker orbital pendant une heure et 30 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez la lame et lavez-la deux fois avec 20 millilitres d’acétylonitrile sec avant de sécher dans une centrifugeuse de microrésais pendant quelques secondes.

Après la première étape de déptection transférer la glissière d’ARN dans la solution hydrazine hydrate, fermer le couvercle et envelopper avec un film d’étanchéité en plastique. Après deux heures de secousses douces sur un shaker orbital, retirez la lame et lavez-la deux fois avec 20 millilitres d’acétylonitrile sec. Ensuite, séchez dans une centrifugeuse de microarray pendant quelques secondes.

Si le microrése d’ARN contient également des nucléotides d’ADN, procédez à une troisième étape de dépprotection. Ajouter le microarray ADN/ARN à un tube de 50 millilitres contenant une solution EDA-éthanol après 5 min à température ambiante, retirer la lame et laver le microrése deux fois avec 20 millilitres d’eau stérile. Séchez la lame dans une centrifugeuse de microrésaille et conservez-la dans un dessiccateur.

Dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, préparez le tampon d’hybridation contenant de l’ADN étiqueté Cy3, tel que décrit dans le protocole du texte. Mélanger et vortex la solution. Placez soigneusement une chambre d’hybridation autoadhésive de 300 microlitres sur la zone de synthèse sur chaque glissière et pipet dans la solution d’hybridation.

Couvrir les trous de la chambre de points adhésifs et envelopper toute la glissière dans du papier d’aluminium. Placez la glissade de microarray dans le four d’hybridation, couvrez-la et laissez-la pivoter doucement à la température d’hybridation sélectionnée pendant deux heures. Après deux heures, détachez la glissière, retirez le papier d’aluminium, pipette la solution d’hybridation, et arrachez soigneusement la chambre d’hybridation.

Transférer les glissières dans un tube de centrifugeuse contenant 30 millilitres de tampon de lavage non rigoureux. Agiter vigoureusement pendant deux minutes à température ambiante. Transférer la glissière dans un tube de centrifugeuse contenant 30 millilitres de tampon de lavage rigoureux et agiter vigoureusement pendant une minute.

Enfin, transférez la glissière dans un tube de centrifugeuse contenant 30 millilitres de tampon de lavage final. Agiter pendant quelques secondes. Séchez la lame dans une centrifugeuse en microarray.

Maintenant, placez le microrése sec, zone de synthèse face vers le bas, dans le support de diapositives du scanner microarray. Pour déprotéger et fendre les bibliothèques d’ADN, plongez la glissière dans la solution de clivage, dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Fermer le tube et envelopper avec un film d’étanchéité en plastique, avant de tourner doucement dans un shaker orbital pendant deux heures à température ambiante.

Après deux heures, retirer la lame et la laver deux fois avec 20 millilitres d’acétylonitrile scrupuleusement sec avant de la laisser sécher à l’air libre. À l’aide d’une pipette, appliquer 100 microlitres d’eau stérile sur la zone de synthèse désormais discernable. Pipet la solution de haut en bas à quelques reprises avant de la transférer dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.

Répétez le processus et combinez l’allongement du microarray dans le même tube. Évaporer la puce évacuez à la sécheresse, puis redissolvez-la en 10 microlitres de H2O sans nucléase. Voici les résultats d’un test d’hybridation effectué sur un microarray contenant les versions ADN et ARN d’une séquence de 25mer.

L’analyse apparaît dans un format greenscale correspondant à l’excitation, spectre d’émission de fluorescence Cy3, avec l’intensité de fluorescence enregistrée dans les unités arbitraires. Il existe une variabilité significative des valeurs absolues de fluorescence entre les expériences. Les résultats de trois synthèses indépendantes utilisant les mêmes paramètres de fabrication et la même manipulation post-synthétique sont affichés.

L’ADN de 25mer, lorsqu’il est hybridé à son brin d’ADN complémentaire étiqueté Cy3, donnera des signaux de fluorescence allant de 20 000 à 30 000, très rarement au-dessus ou au-dessous. L’ARN de 25mer, lorsqu’il est hybridé au même complément d’ADN étiqueté Cy3, donnera des intensités de fluorescence sur les caractéristiques correspondantes allant de 15 000 à 20 000. Cependant, l’intensité de fluorescence des duplex ARN/ADN tombera parfois en dessous de 8000, quand les duplex ADN/ADN correspondants seront encore fluorés dans la fourchette de 20 000 à 30 000.

Dans de tels cas, les résultats de l’ARN peuvent être considérés comme sous-optimaux. Comme pour toute autre expérience basée sur l’ARN, il est important de se rappeler que les microrésiteurs d’ARN sont sensibles à la dégradation et doivent être manipulés dans des conditions stériles. Les bibliothèques d’acide nucléique prélevées dans les microrésaires peuvent être utilisées dans le séquençage de l’ADN ou de l’ARN ainsi que dans l’encodage d’informations numériques sur l’ADN.

Le NED produit une lumière UV intense qui ne doit pas être directement regardée. Pour cette raison, il est conseillé de porter des lunettes de protection pendant que l’instrument est utilisé.