Este protocolo es una de las primeras demostraciones de la aplicación directa del ruido eléctrico a las neuronas individuales en las rebanadas de tejido. Con el fin de observar las respuestas neuronales a los estímulos eléctricos. La principal ventaja de esta técnica es que somos capaces de evaluar un conjunto específico de parámetros de estímulo en las neuronas individuales.
Esta técnica permite la optimización de los parámetros de estímulo para apuntar a tipos neuronales particulares y funcionales. Esto tiene implicaciones para el desarrollo de mejores terapias para la disfunción del equilibrio. Antes de comenzar la extracción del tronco encefálica, Equilibry s-ACSF con CARPOGEN y enfríe la solución a menos 80 grados Celsius durante 25 minutos hasta que se haya formado una suspensión de hielo.
Después de que la solución se haya enfriado, utilice una cuchilla de afeitar redondeada número 22 para hacer una incisión de piel sagital en el cráneo de un ratón C-57 negro de seis a cinco semanas de edad y utilice el extremo puntiagudo de un par de tijeras de patrón estándar para hacer una pequeña incisión, comenzando en la lambda, a lo largo de la sutura sagital. Usando un par de Pierson von Jours de curva poco profunda, refleje cuidadosamente los huesos parietales y exoccipitales reparados, y bañe el cerebro en s-ACSF helado. Luego, aísle el tallo cerebral del antebrao y su encierra ósea usando una cuchilla de afeitar recta número 11 para cortar el sulcus exoccipital parietal y en la negula caudal.
Monte el tallo cerebral aislado ventral y hacia abajo en el bloque de poliestireno trapezoidal cortado permeablemente, y utilice un pedazo de papel tisú para eliminar cualquier exceso de líquido alrededor del tejido diseccionado. Utilice pegamento de cianoacrilato para fijar el bloque de poliestireno a la etapa de corte con el tronco cerebral unido rostral y hacia abajo. Utilice una velocidad avanzada de 0,16 milímetros por segundo y una amplitud de vibración de tres milímetros para obtener cortes transversales de 200 micrómetros de la MVN.
A continuación, utilice una pipeta recortada de plástico para transferir las rodajas de tejido a un disco de papel de filtro con ACSF incarbinginado a 25 grados Centígrados durante al menos 30 minutos. Para la electrofisiología de la abrazadera de parche de células enteras, primero tire de las micro pipetas con una resistencia final que oscilará entre tres y cinco mega Oms cuando se llene con una solución interna a base de potasio y se coloque en el baño. Para obtener grabaciones de abrazaderas de parche de células enteras de neuronas individuales en la MVN, transfiera una sola rebanada de tejido de la cámara de incubación a la cámara de registro de una configuración electrofisiológica estándar, y utilice un hilo de nylon en un peso en forma de U para asegurar la rebanada.
Perfunda continuamente la cámara de grabación con ACSF carbonginado a 25 grados celsius a un caudal de tres mililitros por minuto y llene una micro pipeta con solución interna. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva con una pipeta para alejar los residuos de la punta de la pipeta. Usando un objetivo de menor potencia, localice el MVN antes de cambiar a una alta potencia para localizar neuronas individuales dentro de la MVN.
Antes de romper el tejido con la pipeta, aplique una pequeña cantidad de presión positiva para alejar los residuos de la punta de la pipeta y utilice el micromantenerador para mover la pipeta hacia la neurona seleccionada. Se debe formar un pequeño hoyuelo en la membrana neuronal. Suelte la presión positiva y aplique una pequeña cantidad de presión negativa.
Una vez que se haya logrado un sello Om de un giga, aplique una presión negativa suave y corta al soporte de pipeta a través del puerto de aspiración para romper la membrana y crear una configuración de célula entera. A continuación, obtenga grabaciones de abrazadera de corriente de celda completa de acuerdo con los protocolos estándar. Para aplicar ruido estocástico y sinusoidal a las neuronas del núcleo vestibular medial individual, establezca el rango de amplitudes de tres a 24 picones para determinar el umbral neuronal y la velocidad de disparo y agrupe las intensidades de estímulo más altas y más bajas para determinar el umbral sensorial.
A continuación, calcule la tasa de disparo promedio durante el período de 10 segundos, durante el cual se inyectará el paso de corriente despolarizante para cada nivel de corriente individual. Utilice los valores de la tasa de disparo promedio para generar una tasa de disparo frente a la gráfica actual. A continuación, realice un análisis de regresión lineal para determinar el gradiente de la línea de mejor ajuste para determinar la ganancia neuronal.
Ni el ruido sinusoidal ni el estocástico cambian las tasas de disparo de albahaca de las neuronas MVN en comparación con el control de no hay grabaciones de ruido. En este experimento, el nivel de ruido seleccionado de 6 picones es sub umbral, ya que se puede observar que la tasa media de disparo comienza a aumentar a partir del umbral experimental de 12 picones. Este umbral se determinó objetivamente agrupando los niveles de estímulo por encima y por debajo del umbral experimental.
La ganancia neuronal se evaluó sometiendo las neuronas a un conjunto de pasos actuales despolarizantes de cero a 50 picones en incrementos de 10 pico amperios con y sin ruido. De hecho, el ruido sinusoidal y estocástico aplicado a amplitudes de sub umbral de seis picones puede alterar la ganancia de las neuronas MVN. Los parámetros de estímulo establecidos se pueden aplicar al nervio que innova las neuronas individuales para proporcionar un estímulo más naturalista.
