Dieses Protokoll ist eine der ersten Demonstrationen der direkten Anwendung von elektrischem Rauschen auf einzelne Neuronen in Gewebescheiben. Um neuronale Reaktionen auf elektrische Reize zu beobachten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir in der Lage sind, einen bestimmten Satz von Stimulusparametern auf einzelnen Neuronen zu bewerten.
Diese Technik ermöglicht die Optimierung von Stimulusparametern, um bestimmte, funktionelle neuronale Typen zu zielen. Dies hat Auswirkungen auf die Entwicklung besserer Therapeutika für die Ungleichgewichtsfunktion des Gleichgewichts. Vor Beginn der Hirnstammextraktion, Gleichgewicht s-ACSF mit CARPOGEN und kühlen Sie die Lösung bei minus 80 Grad Celsius für 25 Minuten, bis sich eine Eisschlämme gebildet hat.
Nachdem die Lösung gekühlt ist, verwenden Sie eine Nummer 22 abgerundete Rasierklinge, um einen sagittalen Hautschnitt im Schädel einer drei bis fünf Wochen alten C-57 schwarze Sechsmaus zu machen und verwenden Sie das spitze Ende einer Standard-Musterschere, um einen kleinen Schnitt zu machen, beginnend am Lambda, entlang der sagittalen Naht. Mit einem Paar flachen Biegung Pierson von Jours, sorgfältig reflektieren die reparierten parietalen und exoccipital Knochen, und baden das Gehirn in eiskalten s-ACSF. Dann isolieren Sie den Hirnstamm aus dem Vorderhirn und seine knochenige Ummantelung mit einer Zahl 11 gerade Rasierklinge, um den parietalen exoccipitalen Sulcus und an der kaudalen Negula zu schneiden.
Montieren Sie den isolierten Hirnstamm ventral und unten auf pervily geschnittenen trapezförmigen Polystyrol-Block, und verwenden Sie ein Stück Gewebepapier, um überschüssige Flüssigkeit aus der Umgebung des sezierten Gewebes zu entfernen. Verwenden Sie Cyanoacrylatkleber, um den Polystyrolblock mit dem angeschlossenen Hirnstamm rostral und unten an der Schneidezulage zu fixieren. Verwenden Sie eine erweiterte Geschwindigkeit von 0,16 Millimetern pro Sekunde und eine Vibrationsamplitude von drei Millimetern, um 200 Mikrometer Querscheiben des MVN zu erhalten.
Verwenden Sie dann eine kunststoffbeschnittene Pipette, um die Gewebescheiben mindestens 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius auf eine inkardinierte ACSF mit Filterpapier zu übertragen. Für die Elektrophysiologie der Ganzzell-Patchklemme ziehen Sie zunächst Mikropipetten mit einem Endwiderstand, der von drei bis fünf Mega-Oms reicht, wenn sie mit einer kaliumbasierten internen Lösung gefüllt und in sendertingelegt werden. Um Ganzzell-Patchklemmenaufnahmen von einzelnen Neuronen im MVN zu erhalten, übertragen Sie eine einzelne Gewebescheibe aus der Inkubationskammer in die Aufnahmekammer eines standardelektrophysiologischen Aufbaus und verwenden Sie ein Nylongewinde auf einem U-förmigen Gewicht, um die Scheibe zu sichern.
Durchdringen Sie die Aufnahmekammer kontinuierlich mit carbonginiertem ACSF bei 25 Grad Celsius bei einer Durchflussrate von drei Millilitern pro Minute und füllen Sie eine Mikropipette mit interner Lösung. Wenden Sie eine kleine Menge an positivem Druck mit einer Pipette an, um Schmutz von der Pipettenspitze wegzuschieben. Mit einem niedrigeren Leistungsziel, lokalisieren Sie den MVN vor dem Wechsel zu einer hohen Leistung, um einzelne Neuronen innerhalb des MVN zu lokalisieren.
Bevor Sie das Gewebe mit der Pipette durchbrechen, wenden Sie eine kleine Menge an positivem Druck an, um Schmutz von der Pipettenspitze wegzuschieben, und verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipette in Richtung des ausgewählten Neurons zu bewegen. Ein kleines Dimple sollte sich auf der neuronalen Membran bilden. Lassen Sie den positiven Druck los, und wenden Sie eine kleine Menge an Unterdruck an.
Sobald eine Ein-Giga-Om-Dichtung erreicht ist, wenden Sie einen sanften kurzen und scharfen Unterdruck auf den Pipettenhalter durch den Sauganschluss an, um die Membran zu brechen und eine Ganzzellkonfiguration zu erstellen. Dann erhalten Sie Ganzzellstromklemmenaufzeichnungen nach Standardprotokollen. Um stochastisches und sinusförmiges Rauschen auf einzelne mediale vestibuläre Nukleusneuronen anzuwenden, legen Sie den Bereich der Amplituden von drei bis 24 Pico-Amps fest, um die neuronale Schwelle und Brennrate zu bestimmen und die höheren und niedrigeren Stimulusintensitäten zu gruppieren, um den sensorischen Schwellenwert zu bestimmen.
Als Nächstes berechnen Sie die durchschnittliche Abschussrate über die 10-Sekunden-Periode, in der der depolarisierende Stromschritt für jeden einzelnen aktuellen Pegel injiziert wird. Verwenden Sie die durchschnittlichen Brennratewerte, um eine Abschussrate im Vergleich zum aktuellen Diagramm zu generieren. Führen Sie dann eine lineare Regressionsanalyse durch, um den Gradienten der Linie der besten Anpassung zu bestimmen, um die neuronale Verstärkung zu bestimmen.
Weder sinusförmig noch stochastisch ändert das Basilikum-Feuerraten von MVN-Neuronen im Vergleich zur Kontrolle von Geräuschaufzeichnungen. In diesem Experiment ist der gewählte Rauschpegel von 6 Pico-Ampere Unterschwelle, da man beobachten kann, dass die durchschnittliche Brennrate ab der experimentellen Schwelle von 12 Pico-Amps zu steigen beginnt. Dieser Schwellenwert wurde objektiv durch Gruppierung der Stimulusniveaus oberhalb und unterhalb der experimentellen Schwelle bestimmt.
Der neuronale Gewinn wurde bewertet, indem die Neuronen einer Reihe von depolarisierenden Stromschritten von null bis 50 Pico-Amps in 10 Pico-Amp-Schritten mit und ohne Rauschen unterzogen wurden. Tatsächlich können sinusförmige und stochastische Geräusche, die an Unterschwellenamplituden von sechs Pico-Amps angewendet werden, die Verstärkung von MVN-Neuronen verändern. Die etablierten Stimulusparameter können auf den Nerv angewendet werden, der die einzelnen Neuronen innovativ ist, um einen naturalistischeren Reiz zu bieten.
