Этот протокол является одной из первых демонстраций прямого применения электрического шума к отдельным нейронам в ломтиках тканей. Для того, чтобы наблюдать нейронные реакции на электрические стимулы. Основным преимуществом этой методики является то, что мы можем оценить определенный набор параметров стимула на отдельных нейронах.
Этот метод позволяет оптимизации параметров стимула для целевых конкретных, функциональных типов нейронов. Это имеет последствия для развития лучшей терапии для баланса дисфункции. Перед началом извлечения ствола мозга, Equilibry s-ACSF с CARPOGEN и охладить раствор при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 25 минут, пока ледяная суспензия не образуется.
После того, как раствор остыл, используйте номер 22 округлые лезвия бритвы, чтобы сделать разрез sagittal кожи в черепе от трех до пяти недель C-57 черный шесть мыши и использовать остроконечный конец пары стандартных ножниц шаблон, чтобы сделать небольшой разрез, начиная с lambda, вдоль sagittal шва. Используя пару мелких изгиб Пирсон фон Jours, тщательно отражать отремонтированные теменные и экзокчипитальные кости, и купать мозг в ледяной s-ACSF. Затем, изолировать мозг вытекают из forebrain и его костлявый encasing с помощью числа 11 прямо лезвие бритвы, чтобы сократить темный экзокчипитальный сульс и на хвостовой negula.
Гора изолированных стволовых брюшной мозг и вниз на perviously сократить трапециевидный полистирол блок, и использовать кусок бумаги ткани, чтобы удалить излишки жидкости со всего вскрытой ткани. Используйте цианоакрилат клей, чтобы исправить блок полистирола на стадии резки с прикрепленным стволом мозга рострал и вниз. Используйте передовую скорость 0,16 миллиметра в секунду и амплитуду вибрации в три миллиметра, чтобы получить 200 микрометровых поперечных ломтиков MVN.
Затем используйте пластиковую подстриженную пипету, чтобы перенести ломтики ткани на диск фильтровальной бумаги incarbinginated ACSF при 25 градусах по Цельсию, по крайней мере 30 минут. Для электрофизиологии зажима цельноклеточного пластыря сначала вытяните микротупюты с окончательным сопротивлением, которое будет варьироваться от трех до пяти мега омов при заполнении внутренним раствором на основе калия и помещено в ванну. Чтобы получить записи цельноклеточного патча от отдельных нейронов в MVN, перенесите один кусочек ткани из инкубациольной камеры в камеру записи стандартной электрофизиологической настройки и используйте нейлоновую нить на U-образном весе для защиты ломтика.
Непрерывно пронизываем камеру записи с газированным ACSF при 25 градусах Цельсия со скоростью потока в три миллилитров в минуту и заполняем микрокутетку внутренним раствором. Нанесите небольшое количество положительного давления с помощью пипетки, чтобы отодвинуть мусор от кончика пипетки. Используя более низкую мощность цели, найти MVN, прежде чем перейти на высокую мощность, чтобы найти отдельные нейроны в MVN.
Перед нарушением ткани с пипеткой, применить небольшое количество положительного давления, чтобы отодвинуть мусор от кончика пипетки, и использовать микро-манипулятор для перемещения пипетки к выбранному нейрону. Небольшая ямочка должна образовываться на нейрональной мембране. Отпустите положительное давление и нанесите небольшое количество отрицательного давления.
После того, как один гига Ом печать была достигнута, применять нежный короткий и резкий отрицательное давление на держатель пипетки через всасывающий порт, чтобы разорвать мембрану и создать конфигурацию цельных клеток. Затем получить цельноклеточный ток зажим записи в соответствии со стандартными протоколами. Чтобы применить стохастический и синуситоидный шум к отдельным медиальной вестибулярной нейронов ядра, установить диапазон амплитуд от трех до 24 пико усилителей для определения нейронального порога и скорости стрельбы и группы выше и ниже стимул интенсивности для определения сенсорного порога.
Далее вычислите среднюю скорость стрельбы за 10 секунд, в течение которого будет введен деполяризирующий текущий шаг для каждого отдельного текущего уровня. Используйте средние значения скорости стрельбы для генерации скорости стрельбы по сравнению с текущим сюжетом. Затем выполните линейный регрессионный анализ, чтобы определить градиент линии наилучшей подгонки для определения нейронального усиления.
Ни синуситальный, ни стохастический шум не изменяет скорость стрельбы базиликом нейронов MVN по сравнению с контролем без шумовых записей. В этом эксперименте выбранный уровень шума в 6 пико усилителей является подпостоянным, так как можно замезнать, что средняя скорость стрельбы начинает увеличиваться с экспериментального порога в 12 пико усилителей. Этот порог был объективно определен путем группирования уровней стимулов выше и ниже экспериментального порога.
Нейронное увеличение было оценено путем подвергать нейроны к комплекту depolarizing в настоящее время шагов от zero до 50 усилителей pico в 10 приращениях усилителя pico с и без шума. Действительно, синусоидальный и стохастический шум, применяемый при подпогодных амплитудах шести пикоамперов, может изменить усиление нейронов MVN. Установленные параметры стимула могут быть применены к нерву инноваций отдельных нейронов, чтобы обеспечить более натуралистические стимулы.
