Bu protokol doku dilimlerinde bireysel nöronlar elektriksel gürültü doğrudan uygulama ilk gösterilerinden biridir. Elektriksel uyaranlara verilen nöronal tepkileri gözlemlemek için. Bu tekniğin en büyük avantajı, bireysel nöronlar üzerinde belirli bir dizi uyarıcı parametreleri değerlendirebiliyor olmamızdır.
Bu teknik, uyarıcı parametrelerin optimizasyonunun belirli, fonksiyonel nöronal tipleri hedeflemesine olanak sağlar. Bu denge disfunction için daha iyi terapötik gelişimi için etkileri vardır. Beyin sapı ekstraksiyonbaşlamadana başlamadan önce, CarpoGEN ile Equilibry s-ACSF ve bir buz bulamaç oluşana kadar 25 dakika boyunca eksi 80 santigrat derece çözelti soğutun.
Çözelti soğuduktan sonra, üç ila beş haftalık C-57 siyah altı farekafatasında sagittal deri kesi yapmak için bir sayı 22 yuvarlak jilet kullanın ve standart desen makas sivri ucunu kullanarak küçük bir kesi yapmak için, lambda başlayarak, sagittal sütür boyunca. Pierson von Jours'un sığ bir kıvrımını kullanarak, tamir edilmiş parietal ve exoccipital kemikleri dikkatlice yansıtır ve beyni buz gibi s-ACSF ile yıkar. Sonra, parietal exoccipital sulkus kesmek için bir sayı 11 düz jilet kullanarak ön beyin ve kemikli encasing beyin sapı izole ve kaudal negula.
Mount izole beyin kök ventral ve aşağı perviously kesilmiş trapez polistiren blok, ve parçalanmış doku çevresinde herhangi bir fazla sıvı kaldırmak için kağıt mendil kullanın. Bağlı beyin sapı rostral ve aşağı ile kesme aşamasına polistiren blok düzeltmek için siyanoakrilat tutkal kullanın. MVN'nin 200 mikrometrelik enine dilimlerini elde etmek için saniyede 0,16 milimetre lik gelişmiş bir hız ve üç milimetrelik titreşim genliği kullanın.
Daha sonra doku dilimlerini en az 30 dakika boyunca 25 santigrat derecede hapsedilmiş acsf'ye aktarmak için plastik kesilmiş pipet kullanın. Tüm hücreli yama kıskaç elektrofizyolojisi için, potasyum bazlı bir iç solüsyon ile doldurulup banyoya yerleştirildiğinde üç ila beş mega Om arasında değişen son bir dirençle mikro pipetleri çekin. MVN'deki tek tek nöronlardan tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını elde etmek için, kuluçka odasından standart bir elektrofizyolojik kurulumun kayıt odasına tek bir doku dilimi aktarın ve dilimi sabitlemek için U şeklindebir ağırlık üzerinde naylon iplik kullanın.
Kayıt odasını dakikada üç mililitre lik bir akış hızıyla 25 santigrat derecede karbonginated ACSF ile sürekli olarak aşındırın ve mikro pipeti dahili solüsyonlarla doldurun. Enkazı pipet ucundan uzaklaştırmak için pipet kullanarak az miktarda pozitif basınç uygulayın. Daha düşük bir güç hedefi kullanarak, MVN içinde bireysel nöronlar bulmak için yüksek bir güç geçmeden önce MVN bulmak.
Pipetle dokuyu aşmadan önce, enkazı pipet ucundan uzaklaştırmak için az miktarda pozitif basınç uygulayın ve pipeti seçilen nörona doğru hareket ettirebilmek için mikro manipülatörü kullanın. Nöronal zarda küçük bir gamze oluşmalıdır. Pozitif basıncı bırakın ve az miktarda negatif basınç uygulayın.
Bir giga Om mührü elde edildikten sonra, membranı yırtmak ve tüm hücre yapılandırması oluşturmak için emme portu aracılığıyla pipet tutucuya hafif kısa ve keskin negatif basınç uygulayın. Daha sonra standart protokollere göre tam hücre akım kelepçe kayıtları elde edin. Bireysel medial vestibüler çekirdek nöronlara stoksatik ve sinüzoidal gürültü uygulamak için, nöronal eşik ve atış hızını belirlemek ve grup duyusal eşik belirlemek için üç ila 24 piko amper genliklerin aralığı ayarlayın.
Ardından, depolarizasyon akımı adımının her bir akım düzeyi için enjekte edildiği 10 saniyelik dönemdeki ortalama atış hızını hesaplayın. Geçerli çizime karşı bir atış hızı oluşturmak için ortalama atış hızı değerlerini kullanın. Sonra nöronal kazancı belirlemek için en iyi uyum çizgisinin degrade belirlemek için doğrusal bir regresyon analizi gerçekleştirin.
Ne sinüzoidal ne de stokhastik gürültü mvn nöronların fesleğen ateşleme oranlarını değiştirir kontrol hiçbir gürültü kayıtları ile karşılaştırıldığında. Bu deneyde, 6 piko amperin seçilen gürültü seviyesi alt eşiktir, çünkü ortalama ateşleme hızının 12 piko amperin deneysel eşiğinin artmaya başladığı görülmektedir. Bu eşik, deneysel eşiğin üstündeki ve altındaki uyarıcı düzeylerinin gruplandırılarak objektif olarak belirlenmiştir.
Nöronal kazanç, nöronları gürültülü ve gürültüsüz 10 piko amper de sıfırdan 50 piko amper ekadar depolarize akım basamaklarına maruz kalarak değerlendirildi. Gerçekten de, altı piko amperin alt eşik genliklerinde uygulanan sinüzoidal ve stokhastik gürültü MVN nöronların kazancını değiştirebilir. Kurulan uyarıcı parametrelerdaha doğal bir uyaran sağlamak için bireysel nöronlar yenilik sinir uygulanabilir.
