이 프로토콜은 조직 조각의 개별 뉴런에 전기 잡음의 직접 적용의 첫 번째 데모 중 하나입니다. 전기 자극에 대한 신경 반응을 관찰하기 위해. 이 기술의 주요 장점은 개별 뉴런에 대한 특정 자극 매개 변수 세트를 평가할 수 있다는 것입니다.
이 기술은 특정, 기능신경 유형을 대상으로 자극 매개 변수의 최적화를 허용한다. 이것은 균형 기능 장애에 대한 더 나은 치료법의 개발에 대한 의미가 있습니다. 뇌간 추출을 시작하기 전에 CARPOGEN을 사용하여 S-ACSF를 원평하고 얼음 슬러리가 형성될 때까지 25분 동안 영하 80도의 용액을 식힙니다.
용액이 차가워진 후, 22번 의 둥근 면도날을 사용하여 3~5주 된 C-57 블랙 6마우스의 두개골에 처진 피부 절개를 하고, 람다에서 시작하여 작은 절개를 하기 위해 표준 패턴 가위 한 쌍의 뾰족한 끝을 사용하여 좌골 봉합사를 따라 작은 절개를 합니다. 얕은 벤드 피어슨 폰 주르의 쌍을 사용하여, 조심스럽게 수리 된 정수리와 외수성 뼈를 반사하고, 얼음 차가운 s-ACSF에 뇌를 목욕. 그런 다음, 뇌줄기를 전뇌와 그 뼈가 11번 직선 면도날을 사용하여 정수리 외수성 황액과 소달 부정을 잘라낸다.
격리 된 뇌 줄기 복부를 장착하고 광범위하게 사다리꼴 폴리스티렌 블록을 잘라, 해부 조직 주위에서 여분의 액체를 제거하기 위해 티슈 페이퍼의 조각을 사용합니다. 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 폴리스티렌 블록을 부착된 뇌간 로스트랄 및 다운으로 절단 단계로 고정하십시오. 초당 0.16밀리미터의 고급 속도와 3mm의 진동 진폭을 사용하여 MVN의 200 마이크로미터 가로 조각을 얻습니다.
그런 다음 플라스틱 트리밍 파이펫을 사용하여 조직 조각을 필터 종이 디스크에 전달하여 적어도 섭씨 25도에서 ACSF로 30 분 이상 옮김하십시오. 전세포 패치 클램프 전기생리학의 경우, 칼륨 기반 내부 용액으로 채워지고 욕조에 배치할 때 3메가 옴까지 3메가 옴에 이르는 최종 저항을 가진 마이크로 파이펫을 먼저 당깁니다. MVN의 개별 뉴런으로부터 전세포 패치 클램프 레코딩을 얻으려면, 인큐베이션 챔버에서 표준 전기생리학적 설정의 기록 챔버로 단일 조직 조각을 전송하고, U 자형 중량에 나일론 실을 사용하여 슬라이스를 확보한다.
분당 3밀리리터의 유량으로 25도의 탄산 ACSF로 기록 챔버를 지속적으로 침투시키고 마이크로 파이펫을 내부 용액으로 채웁니다. 파이펫 을 사용하여 소량의 양압을 적용하여 파이펫 끝에서 이물질을 밀어 넣습니다. 낮은 전력 목표를 사용하여 MVN을 찾아 MVN 내에서 개별 뉴런을 찾기 위해 고전력으로 전환하기 전에 MVN을 찾습니다.
파이펫으로 조직을 위반하기 전에 소량의 양압을 적용하여 피펫 끝에서 이물질을 밀어내고 마이크로 조작기를 사용하여 피펫을 선택한 뉴런으로 이동시합니다. 작은 보조개신경막에 형성되어야 합니다. 양압을 방출하고 소량의 음압을 가한다.
기가 옴 씰 1개가 달성되면 흡입 포트를 통해 파이펫 홀더에 부드러운 짧고 날카로운 음압을 적용하여 멤브레인을 파열시키고 전체 셀 구성을 생성합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 전셀 전류 클램프 레코딩을 가져옵니다. 개별 내측 전정 핵 뉴런에 관능 및 부비동성 잡음을 적용하려면 3에서 24 피코 앰프까지 진폭의 범위를 설정하여 신경 임계값을 결정하고 발사 속도를 결정하고 더 높고 낮은 자극 강도를 그룹화하여 감각 임계값을 결정합니다.
다음으로, 10초 기간 동안의 평균 발사 속도를 계산하여 각 개별 전류 레벨에 대해 탈극화 전류 단계를 주입합니다. 평균 발사 속도 값을 사용하여 현재 플롯대비 발사 속도를 생성합니다. 그런 다음 선형 회귀 분석을 수행하여 가장 적합한 선의 그라데이션을 결정하여 신경 이득을 결정합니다.
부비동성이나 금욕적인 소음은 소음 기록 제어를 제어하는 것과 비교하여 MVN 뉴런의 바질 발사 속도를 변경하지 않습니다. 본 실험에서, 선택된 노이즈 레벨 6 피코 앰프는 서브 임계값이며, 평균 발사 속도가 12피코 암페어의 실험 임계값으로부터 증가하기 시작한다는 것을 관찰할 수 있다. 이 임계값은 실험 임계값 을 위와 이하로 그룹화하여 객관적으로 결정되었습니다.
뉴런 이득은 소음 없이 10피코 앰프 단위로 0에서 50 피코 앰프까지 현재 단계의 탈극화 의 제품군에 뉴런을 적용하여 평가되었다. 실제로, 6개의 피코 앰프의 서브 임계값 진폭에 적용된 부비동및 금욕적 잡음은 MVN 뉴런의 이득을 바꿀 수 있다. 확립된 자극 매개변수는 개별 뉴런을 혁신하는 신경에 적용되어 보다 자연스런 자극을 제공할 수 있다.
