Este protocolo é uma das primeiras demonstrações da aplicação direta do ruído elétrico a neurônios individuais em fatias de tecido. A fim de observar respostas neuronais a estímulos elétricos. A principal vantagem desta técnica é que somos capazes de avaliar um conjunto específico de parâmetros de estímulo em neurônios individuais.
Esta técnica permite a otimização de parâmetros de estímulo para atingir tipos neuronais específicos e funcionais. Isso tem implicações para o desenvolvimento de melhores terapêuticas para disfunção de equilíbrio. Antes de iniciar a extração do tronco cerebral, Equilibry s-ACSF com CARPOGEN e esfriar a solução a menos 80 graus Celsius por 25 minutos até que um chorume de gelo tenha se formado.
Depois que a solução esfriar, use uma lâmina de barbear arredondada número 22 para fazer uma incisão de pele sagital no crânio de um rato preto C-57 de três a cinco semanas de idade e use a extremidade pontiaguda de um par de tesouras padrão padrão para fazer uma pequena incisão, começando pela lambda, ao longo da sutura sagital. Usando um par de curvas rasas Pierson von Jours, reflita cuidadosamente os ossos parietal e exoccipital reparados, e banhe o cérebro em gelo frio s-ACSF. Em seguida, isole o cérebro do cérebro do cérebro e sua encanamento ósseo usando uma lâmina de barbear reta número 11 para cortar o sulco exoccipital parietal e na negula caudal.
Monte o ventral isolado do tronco cerebral e para baixo no bloco de poliestireno trapezoidal perviously cortado, e use um pedaço de papel de tecido para remover qualquer excesso de fluido ao redor do tecido dissecado. Use cola cianoacrilato para fixar o bloco de poliestireno ao estágio de corte com o rostral do tronco cerebral ligado e para baixo. Use uma velocidade avançada de 0,16 milímetros por segundo e uma amplitude de vibração de três milímetros para obter fatias transversais de 200 micrômetros do MVN.
Em seguida, use uma pipeta de plástico aparada para transferir as fatias de tecido para um papel filtro de papel incarbinginado ACSF a 25 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Para eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras, primeiro puxe micro pipetas com uma resistência final que irá variar de três a cinco mega Oms quando preenchido com uma solução interna baseada em potássio e colocado no banho. Para obter gravações de grampos de células inteiras de neurônios individuais no MVN, transfira uma única fatia de tecido da câmara de incubação para a câmara de gravação de uma configuração eletrofisiológica padrão, e use um fio de nylon em um peso em forma de U para fixar a fatia.
Perfunda continuamente a câmara de gravação com ACSF carbonginado a 25 graus Celsius a uma taxa de fluxo de três mililitros por minuto e encha uma micro pipeta com solução interna. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva usando uma pipeta para afastar os detritos da ponta da pipeta. Usando um objetivo de potência inferior, localize o MVN antes de mudar para uma alta potência para localizar neurônios individuais dentro do MVN.
Antes de romper o tecido com a pipeta, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva para afastar os detritos da ponta da pipeta e use o micro manipulador para mover a pipeta em direção ao neurônio selecionado. Uma pequena covinha deve se formar na membrana neuronal. Libere a pressão positiva e aplique uma pequena quantidade de pressão negativa.
Uma vez alcançada uma vedação Om de um giga, aplique uma pressão negativa suave e curta ao suporte da pipeta através da porta de sucção para romper a membrana e criar uma configuração de célula inteira. Em seguida, obtenha gravações de grampo de corrente de células inteiras de acordo com os protocolos padrão. Para aplicar ruídos estocásticos e sinusoidais aos neurônios do núcleo vestibular medial individual, defina o intervalo de amplitudes de três a 24 amperes de pico para determinar o limiar neuronal e a taxa de disparo e agrupar as intensidades de estímulo mais e menores para determinar o limiar sensorial.
Em seguida, calcule a taxa média de disparo ao longo do período de 10 segundos, durante o qual a etapa atual despolarizadora será injetada para cada nível atual individual. Use os valores médios da taxa de disparo para gerar uma taxa de disparo em relação ao plot atual. Em seguida, realize uma análise de regressão linear para determinar o gradiente da linha de melhor ajuste para determinar o ganho neuronal.
Nem o ruído sinusoidal nem estocástico alteram as taxas de disparo de manjericão de neurônios MVN em comparação com o controle de não gravações de ruído. Neste experimento, o nível de ruído selecionado de 6 picos é sub-limiar, pois pode-se observar que a taxa média de disparo começa a aumentar a partir do limiar experimental de 12 amperes pico. Esse limiar foi determinado objetivamente pelo agrupamento dos níveis de estímulo acima e abaixo do limiar experimental.
O ganho neuronal foi avaliado submetendo os neurônios a um conjunto de passos atuais despolarizantes de zero a 50 picos em 10 incrementos pico amp com e sem ruído. De fato, o ruído sinusoidal e estocástico aplicado em amplitudes sub-limiar de seis amps pico pode alterar o ganho de neurônios MVN. Os parâmetros de estímulo estabelecidos podem ser aplicados ao nervo que inova os neurônios individuais para fornecer um estímulo mais naturalista.
