Este protocolo es el primero en introducir una lesión estandarizada de tipo contusión en la investigación de regeneración de la médula espinal alotol. La principal ventaja de esta técnica es que imita el trauma visto en la clínica diaria, mejorando la probabilidad de que un hallazgo futuro sea capaz de ser traducido. El dispositivo de lesión por contusión se puede utilizar en cualquier otro modelo animal pequeño de lesión de la médula espinal.
La técnica quirúrgica es difícil, especialmente la laminectomía. Por lo tanto, es aconsejable entrenar el procedimiento en un gran número de animales ex vivo antes de progresar a la cirugía in vivo. Para empezar, coloque una mesa quirúrgica colocando un plato Petri estándar bajo un microscopio estéreo, encima de un paño textil quirúrgico.
Coloque el axolotl anestesiado en la posición propensa en el plato De Petri, y envuélvalo en toallas de papel para que la cola quede expuesta. Identifique las extremidades posteriores y use un par de micro tijeras para hacer que la primera incisión sea caudal para ellas. Haga la incisión vertical desde la quilla hasta que se sienta la prominencia ósea de los procesos espinosos.
Extienda el corte lateralmente, de modo que la incisión recorra toda la anchura de la cola, y agarre los procesos espinosos con fórceps para asegurar una profundidad adecuada. A continuación, extienda la incisión vertical un milímetro por debajo del proceso espinoso en ambos lados. Colocar el animal en un lado, y a partir del punto ventral de la incisión vertical, hacer una incisión horizontal de aproximadamente 15 milímetros para los animales que son de 10 a 20 gramos de peso.
Utilice las tijeras para diseccionar inmediatamente a través de la incisión horizontal hasta que la columna vertebral se sienta en la línea media. A continuación, encienda el animal hacia el otro lado y repita el proceso. Después de diseccionar en el plano medial profundo de ambos lados, disecciona a través de la línea media para conectar las dos incisiones horizontales.
A continuación, mueva la pieza libre de cola y quilla a un lado para exponer los procesos espinosos. Coloque al animal en la posición propensa con la cabeza mirando hacia el lado no dominante del cirujano, y use un par de fórceps para agarrar los procesos espinosos, sólo caudal a las extremidades posteriores. Aplicar un suave levantamiento hacia arriba y hacia la cabeza del animal.
Coloque las cuchillas de un par de micro tijeras horizontales alrededor del proceso y córtelo suavemente, exponiendo la médula espinal. Sujete el caudal del proceso espinoso al que acaba de quitar y repita el proceso. Es imperativo que mantenga una elevación constante en el proceso espinoso para asegurarse de que no inflija daño a la médula espinal cuando se retira.
Si el área expuesta no es lo suficientemente ancha, utilice dos pares de fórceps para agarrar las láminas a ambos lados de la médula espinal y torcerlas lateralmente con un movimiento suave. Al quitar el proceso espinoso, puede ser necesario hacerlo en varios pasos. Por lo tanto, exponer la médula espinal puede tardar varios minutos.
Para introducir una lesión de tipo contusión, utilice un plato de Petri para transferir al animal a la unidad de trauma y brille una linterna en la médula espinal. A continuación, coloque el cilindro de la unidad de trauma de contusión por encima de la médula espinal expuesta utilizando los microajustes, y baje el cilindro hasta que esté nivelado con las láminas. Fije la varilla que cae al electro imán y coloque el cilindro de ajuste de altura de caída deseado en la unidad de trauma.
A continuación, coloque la varilla que cae en el cilindro, apague el electroimán para colocar la varilla en la médula espinal expuesta y utilice el tornillo de ajuste de altura para levantar la varilla hacia arriba. Si introduce una lesión aguda, corte la médula espinal en un corte vertical perfecto, luego repita los cortes de dos milímetros al lado caudal del cuerpo. Siente las cuchillas de las tijeras raspando a lo largo de la parte ventral del canal espinal para asegurar que los cortes estén completos, y levanta la pieza de la médula espinal del canal.
Para cerrar la herida quirúrgica, coloque suturas de nylon de 10 puntos O de la parte más caudal de la incisión horizontal cerrando las heridas en una capa y trabajando hacia la parte vertical de la incisión. Cuando se alcance un ángulo, gire el plato de Petri y sutura la otra incisión horizontal, luego ajuste las suturas en las incisiones verticales. Antes de terminar la anestesia, utilice un ultrasonido de alta frecuencia para adquirir imágenes de la lesión.
Alinee la punta del transductor con el eje de longitud del animal, y sumerja en la solución de benzocaína hasta que esté sólo unos pocos milímetros por encima de la quilla detrás de las extremidades posteriores del animal. Identifique el sitio de lesiones y adquiera imágenes de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cuando haya terminado, devuelva el axolotl a la solución libre de anestesia sumergiendo el plato Petri en agua dulce de cinco centímetros de profundidad y dejando que el animal se deslice.
Las lesiones de la médula espinal creadas con este protocolo fueron validadas usando hematoxilina y tinción de eosina en a los axilotls lesionados y falsos. Para confirmar la regeneración, se prepararon secciones histológicas nueve semanas después de la lesión. Las imágenes mostraron una conexión de la médula espinal restablecida en los animales heridos.
Las lesiones y la regeneración también nos siguen examinando la función neurológica. La reacción del animal a la estimulación de la cola fue puntuada con puntuaciones más altas que indican funciones sensoriales táctiles y nociceptivas más altas. Entre los animales heridos, hubo una pérdida de la función neurológica tres semanas después de la lesión, y una restauración gradual dentro de nueve semanas.
La lesión de la médula espinal también se visualizó utilizando imágenes gráficas ultrasónicas, lo que permitió la visualización de la arteria dorsal como un marcador de la integridad del vaso. Las resonancias magnéticas de campo se realizaron inmediatamente después de la lesión y a las tres, seis y nueve semanas. Estas exploraciones fueron capaces de visualizar el edema y la restauración de la integridad de la médula espinal.
Los escaneos inmediatamente después de una lesión, eran propensos al ruido. La cirugía del paciente y la meticulosa allanarán el camino para un resultado exitoso después de la laminectomía sin daño prematuro a la médula espinal. Después de este procedimiento, se pueden aplicar varios métodos in vivo, como las técnicas de imagen y electrofisiológicas.
