Este protocolo describe el establecimiento de un nuevo modelo de ratón para estudiar el hongo de la piel, Malassezia, y su interacción con la piel de mamífero in vivo. A diferencia de los enfoques in vitro, este modelo de infección permite el estudio de mecanismos inmunes innatos y adaptativos contra Malassezia en toda la complejidad y de una manera específica del tejido. Malassezia se asocia con diversos trastornos de la piel, como la dermatitis atópica.
Comprender la respuesta inmune al hongo puede proporcionar nuevas estrategias para tratar estas enfermedades inflamatorias frecuentes y crónicas de la piel. La infección cutánea experimental con Malassezia proporciona un modelo largamente esperado para estudiar cómo los hongos comensales de la piel modulan el sistema inmunitario y, por lo tanto, afectan el curso y la gravedad de varios trastornos de la piel. Para preparar un Malassezia inoculum añadir 10 mililitros de mDixon líquido medio y tres a cinco colonias individuales de Malassezia de una placa de agar mDixon a un matraz estéril Erlenmeyer de 100 mililitros.
A continuación, coloque el matraz a 30 grados centígrados y 180 rotaciones por minuto durante 48 a 96 horas. Cuando el cultivo es de color crema y turbio, transfiera dos mililitros del cultivo a un tubo estéril de microcentrífuga de dos mililitros y sedimente la levadura por centrifugación. Resuspender el pellet en un mililitro de PBS para una segunda centrifugación seguida de resuspensión en un mililitro de PBS fresco con pipeteo vigoroso.
Diluir la suspensión de Malassezia 20 a 50 veces con PBS para asegurar que la lectura está entre 0,1 y una y medir el OD 600 en un espectrómetro. Aliquot un volumen de la suspensión Malassezia en PBS que corresponde a un OD 600 de cuatro en un tubo estéril de dos mililitros por animal para ser infectado y sedimentar la levadura por centrifugación. Luego resuspender los pellets en 200 microlitros de aceite de oliva nativo.
Para iniciar una infección por Malassezia, confirme una falta de respuesta al reflejo del pedal en un ratón C57 Black6 hembra anestesiado de seis a ocho semanas de edad y aplique ungán en los ojos del animal. Utilice una pinza para medir el grosor de dos áreas diferentes de ambas orejas para permitir el cálculo del espesor medio por oído. A continuación, aplique un pequeño trozo de cinta adhesiva en la piel de una oreja antes de retirar rápidamente la cinta de la piel del oído cinco veces con un nuevo trozo de cinta cada vez.
Después de la extracción, utilice una pipeta estéril para aplicar 100 microlitros de la suspensión de aceite de oliva Malassezia al lado dorsal de cada oreja e inyecte 200 microlitros de solución estéril de 2% glucosa precalentada por vía subcutánea en el pliegue nucal para apoyar el metabolismo y la rehidratación. A continuación, deje que el ratón se recupere en una almohadilla de calentamiento durante 30 minutos con monitoreo antes de devolver el animal a su jaula. En los puntos de tiempo experimentales apropiados, utilice una pinza para medir dos áreas diferentes de cada oreja de ratón para permitir el cálculo del grosor medio por oído.
Para medir la carga de hongos en la piel infectada, agregue 500 microlitros de 0,05%NP40 estériles en agua destilada y una bola de acero autoclaved de cinco mililitros de diámetro a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros por oído y pese cada tubo en una balanza. A continuación, cosecha las orejas de cada animal en la base y coloca los tejidos en tubos individuales de NP40. Pesar cada tubo en la balanza para determinar el peso de cada muestra de oído antes de homogeneizar los tejidos del oído durante seis minutos a 25 hercios.
A continuación, dispensar 100 microlitros de cada muestra en placas de agar mDixon y distribuir las suspensiones de forma homogénea a través del agar antes de su incubación al revés a 30 grados centígrados. Aquí se muestran imágenes representativas para el crecimiento de Malassezia sympodialis en medio mDixon líquido y en agar mDixon como se ha demostrado. Se puede observar un aumento en el grosor del oído después de la aplicación de Pelaje Malassezia a la piel que se ha interrumpido la barrera en comparación con la piel no perturbada de ratones salvajes de tipo C57 Black6.
De hecho, la cuantificación del aumento del grosor del oído con el tiempo revela que el cambio de grosor es significativo en comparación con la piel tratada con vehículo. Además, la carga fúngica en la piel del oído en el segundo día después de la infección con Malassezia pachydermatis es 100 a 1000 veces superior al límite de detección. Malassezia tiende a formar agregados y no es fácilmente suspendible.
Por lo tanto, asegurar la homogeneización de la suspensión del hongo aceite por vórtice extenso. Las lecturas adicionales pueden incluir, histología para determinar la patología de la piel y el aislamiento de las células inmunitarias de la piel y los ganglios linfáticos drenantes para investigar la respuesta inmune antifúngica. Este modelo abre las oportunidades para estudiar la respuesta inmune contra Malassezia e investigar el papel del hongo como un commensal en el contexto de diversos trastornos de la piel.
Las especies de Malassezia están clasificadas como organismos BSL-2 en algunos países. Asegúrese de seguir la normativa de sus autoridades locales y de utilizar las medidas de seguridad adecuadas.
