이 프로토콜은 피부 곰팡이, 말라세지아, 그리고 생체 내 포유류 피부와의 상호 작용을 연구하기 위해 새로운 마우스 모델의 설립을 설명합니다. 체외 접근법과는 대조적으로, 이 감염 모형은 완전한 복잡성 및 조직 특정 방식으로 Malassezia에 대하여 선천적이고 적응적인 면역 기계장치의 연구를 허용합니다. 말라세치아는 아토피성 피부염과 같은 다양한 피부 질환과 관련이 있습니다.
곰팡이에 대한 면역 반응을 이해하면 이러한 빈번한 만성 염증성 피부 질환을 치료하는 새로운 전략을 제공 할 수 있습니다. Malassezia를 가진 실험적인 피부 감염은 피부 막증 곰팡이가 면역 계통을 변조하고 그로 인하여 각종 피부 무질서의 과정 그리고 엄격에 어떻게 영향을 미치는지 연구하기 위한 오래 기다려온 모형을 제공합니다. 말라세지아 의 접종을 준비하기 위해 액체 mDixon 배지 10 밀리리터와 mDixon agar 플레이트에서 멸균 100 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에 3~5개의 개별 말라세지아 식민지를 추가합니다.
그런 다음 플라스크를 섭씨 30도, 분당 180회전으로 48~96시간 동안 배치합니다. 문화가 크림 색과 탁구인 경우, 배양의 2 밀리리터를 멸균 2 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮기고 효모를 원심분리에 의해 퇴적시한다. 두 번째 원심분리를 위해 PBS의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 활발한 파이펫팅으로 신선한 PBS의 1밀리리터에서 재서스펜션을 합니다.
측정값이 0.1에서 1 사이인지 확인하기 위해 PBS로 Malassezia 서스펜션을 20~50회 희석하고 분광계에서 OD 600을 측정합니다. Aliquot는 PBS에서 Malassezia 현탁액의 부피를 4마리의 OD 600에 대응하는 동물당 멸균 2밀리리터 튜브에 감염되어 원심분리에 의해 효모를 퇴적시한다. 그런 다음 200 마이크로리터의 토착 올리브 오일로 펠릿을 다시 중단합니다.
Malassezia 감염을 시작하기 위하여는, 마취된 6-8 주 된 여성 C57 Black6 마우스에 있는 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인하고 동물의 눈에 연고를 적용합니다. 캘리퍼를 사용하여 양 귀의 두 가지 영역의 두께를 측정하여 귀당 평균 두께를 계산할 수 있습니다. 그런 다음 한 귀의 피부에 작은 테이프를 바르고 매번 새 테이프를 사용하여 귀 피부에서 테이프를 5번 빠르게 제거합니다.
제거 후 멸균 파이펫을 사용하여 말라세치아 올리브 오일 현탁액 100마이크로리터를 각 귀의 등쪽 측에 적용하고 200마이크로리터의 멸균, 미리 데워진 2%의 포도당 용액을 누칼 접기에 피하하여 대사와 재수화를 지원합니다. 그런 다음 마우스가 동물을 케이지로 되돌리기 전에 모니터링을 통해 30분 동안 가열 패드에서 복구할 수 있도록 합니다. 적절한 실험 시점에서 캘리퍼를 사용하여 각 마우스 귀의 두 가지 영역을 측정하여 귀당 평균 두께를 계산할 수 있습니다.
감염된 피부의 곰팡이 부담을 측정하려면 증류수에 멸균 0.05%NP40의 마이크로리터 500마이크로리터를 넣고 오토클레이드 직경 5개의 스틸볼을 귀당 2밀리리터 마이크로센티르슈에게 튜브에 넣고 각 튜브의 무게를 균형에 무게를 실어주세요. 다음으로, 기지에 있는 각 동물에게서 귀를 수확하고 조직을 NP40의 개별 관에 놓습니다. 25 Hertz에서 6 분 동안 귀 조직을 균질화하기 전에 각 귀 샘플의 무게를 결정하기 위해 균형에 각 튜브의 무게를 무게.
그런 다음 각 샘플의 100 마이크로리터를 mDixon 한천 플레이트에 분배하고 30°C의 거꾸로 잠복하기 전에 한천을 균일하게 분배합니다. 여기서 는 액체 mDixon 매체와 mDixon agar에서 말라세지아 심포다이얼의 성장을 위한 대표적인 이미지가 시연된다. 말라세지아 퍼푸르를 야생형 C57 Black6 마우스의 흔들리지 않는 피부에 비해 장벽이 중단된 피부에 적용한 후 귀 두께의 증가를 관찰할 수 있다.
실제로, 시간이 지남에 따라 귀 두께의 증가의 정량화는 두께의 변화가 차량 처리 피부에 비해 중요하다는 것을 알 수 있습니다. 또한, 말라세지아 파키드르막티스감염 후 둘째 날 귀 피부의 곰팡이 부담은 검출 한계보다 100~1000배 높은 수치이다. 말라세지아는 골재를 형성하는 경향이 있으며 쉽게 일시 중단할 수 없습니다.
따라서 광범위한 소용돌이에 의해 오일 곰팡이 현탁액의 균질화를 보장하십시오. 추가 판독은 피부 병리학 및 피부로부터 면역 세포의 분리를 결정하고 항진균 면역 반응을 조사하기 위해 림프절을 배출하는 조직학을 포함 할 수 있습니다. 이 모델은 말라세치아에 대한 면역 반응을 연구하고 다양한 피부 질환의 맥락에서 교반기로서의 곰팡이의 역할을 조사 할 수있는 기회를 열어줍니다.
말라세치아 종은 일부 국가에서 BSL-2 유기체로 분류됩니다. 지방 자치 단체의 규정을 준수하고 적절한 안전 조치를 사용해야합니다.
